趙 權(quán)

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林，132101)

王 軍

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué))

楊成君

(東北林業(yè)大學(xué))

酚類物質(zhì)是葡萄漿果中一種重要的次生代謝產(chǎn)物，對葡萄漿果和葡萄酒的感官質(zhì)量有重要影響，尤其對紅葡萄酒的色澤、苦味、收斂性、澄清度和穩(wěn)定性等起重要作用［1－3］。前人研究表明，酚類物質(zhì)具有防癌抗癌［4－7］、免疫調(diào)節(jié)活性［8］、預(yù)防心腦血管疾?。?］、抗疲勞［10］、抗過敏及抗炎、改善視覺功能［11］、保護(hù)肝臟、清除自由基、抗突變、降低血清膽固醇等作用［12］。非花色苷酚類物質(zhì)是指除花色苷以外的酚類物質(zhì)，包括苯甲酸類、肉桂酸類、黃烷－3－醇類、黃酮醇類、白藜蘆醇類。這些物質(zhì)在葡萄酒發(fā)酵及陳釀過程中的變化極其復(fù)雜，對葡萄酒的質(zhì)量有很大的影響［13－15］。葡萄漿果中含有大量非花色苷酚類物質(zhì)，主要分布于果皮、種子和果梗中，在葡萄酒釀造過程中這些物質(zhì)被浸漬到葡萄酒中。山葡萄(Vitis amuremsis Rupr.)是東北地區(qū)釀造葡萄酒的主要原料，山葡萄酒具有甜酸可口、濃郁醇厚、余味綿長之特點，長期飲用可促進(jìn)血液循環(huán)，消除疲勞，增強(qiáng)體質(zhì)［16］。目前，國內(nèi)外對歐亞葡萄果皮及酒非花色苷酚的種類、質(zhì)量分?jǐn)?shù)等研究較多［17－21］，但是對山葡萄的研究較少，特別是對山葡萄果皮和酒中非花色苷酚種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的研究未見報道。

本研究以7個山葡萄品種為材料，利用HPLCMS/MS技術(shù)對山葡萄果皮和酒中非花色苷酚種類及質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行分析，探討不同品種山葡萄果皮和酒中非花色苷酚的組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異及特點，研究結(jié)果將為山葡萄酒的加工以及品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

以山葡萄左山一、左山二、左紅一、左優(yōu)紅、雙豐、雙紅、雙優(yōu)7個品種為試驗材料，于2008年9月份采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所國家山葡萄種質(zhì)資源圃。果實為商品成熟期，左山一、左山二、雙豐采摘時期為9月8日;左紅一、左優(yōu)紅、雙紅、雙優(yōu)采摘時期為9月10日。

流動相甲醇(HPLC)、乙腈(HPLC)、冰醋酸(HPLC)均購于 Fisher公司(Fairlawn，NJ，USA)，采用 Milli－Q(Milipore，Bedford，MA)系統(tǒng)制備的超純水。標(biāo)準(zhǔn)樣品沒食子酸、兒茶素、咖啡酸、白藜蘆醇、槲皮素均由 Sigma(Chemical Co.，St.Louis，USA)公司購買。

KG2200B型超聲波清洗器;RE－52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;SHZ－III型循環(huán)水真空泵。Agilent 1200系列LC/MSD離子阱液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀、G1379A真空溶劑脫氣機(jī)、G1311A四元高壓梯度泵、G1313A自動進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315A二極管陣列檢測器(DAD)，所有儀器均由Agilent 5.3版本的化學(xué)工作站控制。

山葡萄果皮中非花色苷酚的提取:山葡萄剝皮，液氮研磨成粉末，冷凍干燥。稱取5.000 g粉末加入50 mL 90%的丙酮水溶液，在室溫條件下，水浴搖床浸提 30 min，離心(4000 r·min－1，5 min)，重復(fù)提取5次，合并提取液，30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘留物用甲醇定容到5 mL，－20℃保存待測。

山葡萄酒的釀造及酒中非花色苷酚類物質(zhì)的萃取:葡萄漿果→精選→破碎→主發(fā)酵→皮渣分離(第4 d)→加相應(yīng)葡萄品種濃縮汁→后發(fā)酵→倒罐→原酒→澄清過濾→陳釀→ －40℃冷凍保存(第30 d)，待測。此時，7個山葡萄酒的酒精度為10.7% ～11.8%，總酸度為8～10.5，符合國家山葡萄酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。葡萄酒樣的萃取條件根據(jù)Garcia－Viguera et al.［22］并有所改動。用 100 mL容量瓶分別取 100 mL的葡萄酒樣和100 mL水，混合后，用80 mL的乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，均用分液漏斗提取分離，酯相部分30℃進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，殘留物溶解定容到5 mL的甲醇色譜純中，并置－30℃避光保存?zhèn)溆?，在HPLC分析前用0.45 μm膜過濾。

高效液相色譜—質(zhì)譜(HPLC－DAD－MS)分析:試驗采用Agilent 1100系列LC/MSD離子阱液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及實際酒樣的LCUV－MS分析，包括在線G1379A真空溶劑脫氣機(jī)、G1311A四元高壓梯度泵、G1313A自動進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315A二極管陣列檢測器(DAD)。色譜柱采用反相 250×4.6 mm，5 μm 的Zorbax SB C－18柱(Agilent Technologies)。流動相A:1.0%的醋酸水溶液;流動相B:1.0%醋酸甲醇溶液。洗脫程序:0～15 min，10% ～26%B;15～30 min，26% ～40%B;30～50 min，40% ～65%B;50～60 min，65% ～95%B;60 ～63 min，95% ～10%B;63 ～66 min，10%B。流速 1.0 mL·min－1;柱溫 25℃;檢測波長280 nm;進(jìn)樣量10 μL。MSD參數(shù):離子源為ESI，采用負(fù)離子模式;霧化氣壓力為30 psi;干燥氣流速為10 mL·min－1;干燥氣溫度為325℃;離子掃描范圍為100～1500 m·z－1。CID的MS/MS誘導(dǎo)碰撞能量為1.0 V。

非花色苷酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:配制8個質(zhì)量濃度水平的5種混標(biāo)，每個水平重復(fù)3次，以各組分的平均峰面積(y)對質(zhì)量濃度(ρ，mg·L－1)在工作站中建立標(biāo)準(zhǔn)曲線［23－25］，非花色苷酚標(biāo)準(zhǔn)品、線性方程及相關(guān)系數(shù)見表1。結(jié)果表明，5種標(biāo)準(zhǔn)酚類化合物在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均在0.998以上，說明線性良好，可以滿足定量的需要。

表1 5種非花色苷酚的線性方程及相關(guān)系數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種山葡萄果皮中非花色苷酚成分及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)

應(yīng)用HPLC－MS/MS技術(shù)，從7個品種山葡萄果皮中共檢測出非花色苷酚18種(表2和圖1)，其中苯甲酸類3種，肉桂酸類4種，黃烷－3－醇類3種，黃酮醇類5種，白藜蘆醇類3種。

由表2和圖1可以看出，不同品種山葡萄果皮檢測出的非花色苷酚成分種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有差別。左山一檢測出非花色苷酚12種，其中苯甲酸類2種，肉桂酸類3種，黃烷－3－醇類1種，黃酮醇類5種，白藜蘆醇類1種。所有非花色苷酚成分中，槲皮素3－O－葡萄糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為365.302 μg·g－1。

左山二檢測出非花色苷酚12種，其中苯甲酸類3種，肉桂酸類3種，黃烷－3－醇類2種，黃酮醇類4種，白藜蘆醇類未檢測到。所有非花色苷酚成分中，反式—楊梅酮3－O－葡萄糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為138.762 μg·g－1。

左紅一檢測出非花色苷酚15種，其中苯甲酸類2種，肉桂酸類4種，黃烷－3－醇類1種，黃酮醇類5種，白藜蘆醇類3種。槲皮素3－O－葡萄糖苷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為 446.467 μg·g－1。

左優(yōu)紅檢測出非花色苷酚15種，其中苯甲酸類3種，肉桂酸類4種，黃烷－3－醇類1種，黃酮醇類5種，白藜蘆醇類2種。其中反式—楊梅酮3－O－葡萄糖苷為質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高物質(zhì)，為 136.653 μg·g－1。

雙紅檢測出非花色苷酚13種，其中苯甲酸類1種，肉桂酸類3種，黃烷－3－醇類3種，黃酮醇類4種，白藜蘆醇類2種。其中反式—單咖啡酰酒石酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為 1020.612 μg·g－1。

圖1 不同品種山葡萄果皮中非花色苷酚HPLC色譜圖

雙優(yōu)檢測出非花色苷酚10種，其中苯甲酸類2種，肉桂酸類3種，黃烷－3－醇類1種，黃酮醇類4種，白藜蘆醇類未檢測到。其中槲皮素3－O－葡萄糖苷酸為質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高物質(zhì)，為 427.122 μg·g－1。

雙豐檢測出非花色苷酚10種，其中苯甲酸類2種，肉桂酸類3種，黃烷－3－醇類1種，黃酮醇類4種，白藜蘆醇類未檢測到。其中槲皮素3－O－葡萄糖苷為質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高物質(zhì)，為 452.82 μg·g－1。

7個品種比較顯示，雙紅非花色苷酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為 3172.907 μg·g－1，之后依次為左紅一、雙優(yōu)、雙豐、左山一、左山二、左優(yōu)紅。

對7個品種山葡萄果皮中的苯甲酸類、肉桂酸類、黃烷－3－醇類、黃酮醇類、白藜蘆醇類5類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，肉桂酸類和黃酮醇類是山葡萄果皮非花色苷酚的主要化合物，這2類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于其他3類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。其中左山一黃酮醇類質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總非花色苷酚的61.31%，肉桂酸類占23.74%，苯甲酸類、黃烷－3－醇類、白藜蘆醇類3類僅占14.95%。左山二黃酮醇類質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總非花色苷酚的57.51%，苯甲酸類和肉桂酸類分別占16.29%和11.55%，黃烷－3－醇類占14.65%，在7個品種中所含的比例最高。左紅一黃酮醇類占總非花色苷酚的55.42%，其次為肉桂酸類23.39%，白藜蘆醇類占11.91%。左優(yōu)紅黃酮醇類占47.25%，其次為肉桂酸類，占24.86%，白藜蘆醇類占15.45%，在7個品種中所含的比例最高。雙紅黃酮醇類占58.56%，其次為肉桂酸類，占36.12%，苯甲酸類、黃烷－3－醇類、白藜蘆醇類3類僅占5.32%。雙優(yōu)黃酮醇類占74.78%，其次為肉桂酸類，占16.04%。雙豐黃酮醇類占72.41%，其次為肉桂酸類，占20.75%。

表2 不同品種山葡萄果皮中非花色苷酚的HPLC－MS/MS鑒定成分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.2 不同品種山葡萄酒中非花色苷酚成分及其質(zhì)量濃度

應(yīng)用HPLC－MS/MS技術(shù)，從7個品種山葡萄酒中共檢測出非花色苷酚30種(表3和圖2)，其中苯甲酸類5種，肉桂酸類7種，黃烷－3－醇類5種，黃酮醇類9種，白藜蘆醇類4種。

表3 不同品種山葡萄酒中非花色苷酚的HPLC－MS/MS鑒定成分及質(zhì)量濃度

表3 (續(xù))

由表3和圖2可以看出，不同品種山葡萄酒非花色苷酚成分種類和質(zhì)量濃度差別較大。左山一酒中檢測出非花色苷酚21種，其中苯甲酸類5種，肉桂酸類5種，黃酮醇類8種，白藜蘆醇類2種，黃烷－3－醇類1種。所有非花色苷酚成分中，反式—香豆酰酒石酸質(zhì)量濃度最高，為 8.063 mg·L－1。

左山二檢測出非花色苷酚19種，其中苯甲酸類5種，肉桂酸類5種，黃烷－3－醇類1種，黃酮醇類7種，白藜蘆醇類1種。所有非花色苷酚成分中，反式—單咖啡酰酒石酸質(zhì)量濃度最高，為43.427 mg·L－1。

左紅一檢測出非花色苷酚20種，其中苯甲酸類5種，肉桂酸類4種，黃烷－3－醇類2種，黃酮醇類7種，白藜蘆醇類2種。反式—單咖啡酰酒石酸質(zhì)量濃度最高，為 66.872 mg·L－1。

左優(yōu)紅檢測出非花色苷酚25種，其中苯甲酸類5種，肉桂酸類7種，黃烷－3－醇類5種，黃酮醇類6種，白藜蘆醇類2種。其中原花色素B1質(zhì)量濃度最高，為 63.861 mg·L－1。

雙紅檢測出非花色苷酚21種，其中苯甲酸類5種，肉桂酸類5種，黃烷－3－醇類2種，黃酮醇類8種，白藜蘆醇類1種。其中反式—單咖啡酰酒石酸質(zhì)量濃度最高，為 94.324 mg·L－1。

雙優(yōu)檢測出非花色苷酚17種，其中苯甲酸類5種，肉桂酸類5種，黃烷－3－醇類未檢測到，黃酮醇類6種，白藜蘆醇類1種。其中丁香酸為質(zhì)量濃度最高物質(zhì)，為 8.897 mg·L－1。

雙豐檢測出非花色苷酚20種，其中苯甲酸類5種，肉桂酸類6種，黃烷－3－醇類2種，黃酮醇類5種，白藜蘆醇類2種。反式—單咖啡酰酒石酸質(zhì)量濃度最高，為 32.652 mg·L－1。

7個品種比較顯示，左優(yōu)紅酒中非花色苷酚質(zhì)量濃度最高，為 240.965 mg·L－1，之后依次為雙紅、左紅一、左山二、雙豐、左山一、雙優(yōu)。

對7個品種山葡萄酒中的苯甲酸類、肉桂酸類、黃烷－3－醇類、黃酮醇類、白藜蘆醇類5類化合物的質(zhì)量濃度進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，苯甲酸類、肉桂酸類和黃酮醇類是左山一酒中主要的非花色苷酚物質(zhì)，分別占總質(zhì)量濃度的37.75%、30.26%和23.85%，白藜蘆醇類僅占1.01%。左山二肉桂酸類質(zhì)量濃度最高占62.87%，其次是黃酮醇類和苯甲酸類分別占17.02%、12.94%。左紅一肉桂酸類質(zhì)量濃度最高，占48.26%，其次是黃烷－3－醇類占 27.53%。白藜蘆醇類占2.06%。左優(yōu)紅中質(zhì)量濃度最高的是黃烷－3－醇類，占48.20%，其次是肉桂酸類占39.12%。雙紅中肉桂酸類質(zhì)量濃度最高，占48.08%，黃烷－3－醇類和黃酮醇類質(zhì)量濃度基本相同，分別占21.05%和22.40%。雙優(yōu)酒中沒有檢測到黃烷－3－醇類化合物。其酒中苯甲酸類質(zhì)量濃度最高，占41.60%，肉桂酸類和黃酮醇類質(zhì)量濃度基本相同，分別占28.90%和26.09%，白藜蘆醇類占3.41%，是7個品種中所占比例最高的。雙豐酒中肉桂酸類質(zhì)量濃度最高，占69.50%，其次是苯甲酸類，占 17.99%。

圖2 不同品種山葡萄酒中非花色苷酚HPLC色譜圖

3 結(jié)論與討論

近年來，我國葡萄酒企業(yè)為了保持國內(nèi)市場優(yōu)勢和不斷開拓國外市場，都不同程度地注重了葡萄酒的質(zhì)量穩(wěn)定和提高。酚類物質(zhì)是葡萄漿果中重要的次生代謝產(chǎn)物，在葡萄酒釀造過程中通過浸漬溶到酒中，對葡萄酒的色澤、風(fēng)味和口感上的收斂性有重要影響，構(gòu)成葡萄酒的“骨架成分”，被作為評判干型葡萄酒質(zhì)量的關(guān)鍵組分，多年來，這一直為國內(nèi)外葡萄與葡萄酒研究領(lǐng)域中的熱點。但是目前山葡萄酒市場混雜，標(biāo)簽混亂，單品種酒少，勾兌酒居多，真假難辨已成為制約我國山葡萄酒產(chǎn))業(yè)發(fā)展的因素。穩(wěn)定和提高山葡萄酒質(zhì)量，并與國際先進(jìn)葡萄酒技術(shù)盡快接軌，從而有力地推動了我國特色山葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展壯大。現(xiàn)代發(fā)展起來的高效液相色譜—質(zhì)譜(HPLC－MS/MS)技術(shù)，已成為酚類物質(zhì)分析最有效的工具之一，本試驗利用HPLC－MS/MS聯(lián)用技術(shù)，分析不同品種山葡萄果皮和酒中非花色苷酚成分的差異，結(jié)果表明，不同品種山葡萄果皮非花色苷酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酒中非花色苷酚質(zhì)量濃度及組成比例不同，其組成具有品種特征，肉桂酸類和黃酮醇類是山葡萄果皮及酒非花色苷酚的主要化合物，左優(yōu)紅酒與之不同，以黃烷－3－醇類和肉桂酸類為主。研究山葡萄果皮及酒中的酚類物質(zhì)種類及組成比例特征，將為山葡萄品種、山葡萄酒原料品種以及山葡萄酒營養(yǎng)保健等方面的鑒定提供科學(xué)的依據(jù)。

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