浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所 許少春 李艷麗 柳 永 許堯興＊

研究表明，飼料中添加復(fù)合酶制劑的飼喂效果優(yōu)于單一酶制劑（李吉祥等，2007）。然而現(xiàn)在的復(fù)合酶一般是由單一酶復(fù)配而來的，應(yīng)用成本較高。因此，研究復(fù)合酶的高效生產(chǎn)方法勢在必行。本文在前期篩選獲得高產(chǎn)α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的單一黑曲霉菌株的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對混合菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵條件研究，為復(fù)合酶制劑的高效產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基 黑曲霉變種（A.niger v.Tiegh CGMCC1182）為 α-半乳糖苷酶（α）生產(chǎn)菌株，酶活力可達(dá)245 IU/g（許堯興等，2009）；黑曲霉MA-56（A.niger MA-56 CGMCC2722）為 β-甘露聚糖酶（β）生產(chǎn)菌株，酶活力可達(dá)1101 IU/g（李艷麗等，2009）；黑曲霉 XY-1（A.niger XY-1 CGMCC1182）為木聚糖酶（X）生產(chǎn)菌株，酶活力可達(dá)9478 IU/g（Xu 等，2008）。

斜面保藏培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯 200 g/L，蔗糖20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH。

混菌發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（M-M），根據(jù)三種酶單一生產(chǎn)的培養(yǎng)基配方進(jìn)行組合確定：麩皮8 g，豆粕 2 g，玉米芯 2 g，魔芋粉 0.1 g，葡萄糖 0.5 g，（NH4）2SO40.2 g，NaNO30.2 g，MgSO40.1g，KH2PO40.2 g，H2O 11 mL。進(jìn)行營養(yǎng)因子條件試驗(yàn)時(shí)，各成分的含量根據(jù)實(shí)際情況確定。

1.2 培養(yǎng)條件 將在PDA斜面上生長4～5 d的三種酶制劑的黑曲霉菌株的孢子用30 mL無菌水洗脫，并按1∶1∶1的比例制成混合孢子懸浮液。吸取2 mL孢子懸浮液至裝有11 g（按干基質(zhì)）發(fā)酵培養(yǎng)基的300 mL三角瓶中，并攪拌均勻。28～30℃培養(yǎng)56 h。

1.3 酶活測定

1.3.1 粗酶液制備 將發(fā)酵后的培養(yǎng)物于40℃烘干，粉碎。稱取一定量的固體酶樣，加入適量的水，40℃水浴抽提30 min，用濾紙過濾，濾液即為粗酶液。依據(jù)發(fā)酵產(chǎn)物中α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的酶活高低，粗酶液再作適當(dāng)?shù)亩蜗♂尮y定。

1.3.2 酶活測定 α-半乳糖苷酶采用許堯興等（2004）的pNPG法并略作修改。取經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液0.5 mL，加入0.1 mol/L pH4.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液1.0 mL，5 mmol/L對硝基苯-D-α-半乳糖苷（pNPG，Sigma）0.5 mL，于 40 ℃水浴精確反應(yīng)10 min，加入0.5 mol/L Na2CO3溶液2.0 mL終止反應(yīng)，于400 nm處測分光光度值。酶活力定義：在上述條件下，每分鐘分解底物生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量為1個(gè)酶活單位（IU/g）。β-甘露聚糖酶和木聚糖酶酶活測定采用DNS法，測定條件為pH 5.5和40℃。一個(gè)單位的酶活定義為在測定條件下1 min內(nèi)水解底物產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol還原糖的酶量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 運(yùn)用SAS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并在0.05水平上進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基組成對黑曲霉混合菌發(fā)酵生產(chǎn)復(fù)合酶的影響

2.1.1 發(fā)酵培養(yǎng)基中麩皮、豆粕質(zhì)量比對固態(tài)混菌發(fā)酵復(fù)合酶生產(chǎn)的影響 在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，其他因素不變通過改變麩皮與豆粕粉的質(zhì)量比對復(fù)合酶產(chǎn)量的影響見圖1。結(jié)果表明，麩皮與豆粕粉質(zhì)量比在7∶3時(shí)，α-半乳糖苷酶酶活達(dá)到最大251 IU/g；麩皮與豆粕粉質(zhì)量比在9∶1～6∶4時(shí)，β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的活力都較高，且酶活相差不大，說明在一定范圍內(nèi)麩皮與豆粕粉的質(zhì)量比對β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的活力影響不大。綜合α-半乳糖苷酶酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶三種酶活力和價(jià)格因素，在以后的試驗(yàn)中選用麩皮與豆粕粉質(zhì)量比為7∶3，三種酶制劑的活力分別可以達(dá)到 251、879、6144 IU/g。

2.1.2 玉米芯添加量對固態(tài)混菌發(fā)酵復(fù)合酶生產(chǎn)的影響 絕大多數(shù)產(chǎn)木聚糖酶菌株的產(chǎn)酶可以被木聚糖所誘導(dǎo)。玉米芯中木聚糖的含量可達(dá)35%以上，但玉米芯的添加對α-半乳糖苷酶和β-甘露聚糖酶的生產(chǎn)影響卻是未知的。因此，以培養(yǎng)基中麩皮與豆粕粉質(zhì)量比7∶3為基礎(chǔ)，其他因素不變，研究了玉米芯不同用量對混菌發(fā)酵復(fù)合酶生產(chǎn)的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可見，玉米芯的添加對α-半乳糖苷酶和β-甘露聚糖酶的生產(chǎn)有抑制作用，當(dāng)培養(yǎng)基中玉米芯添加量在1.0 g以下時(shí)，二者酶活均平穩(wěn)下降，而隨著玉米芯添加量的逐漸增大，酶活呈急劇下降的趨勢；但玉米芯的添加卻對木聚糖酶的生產(chǎn)有激活作用，當(dāng)培養(yǎng)基中玉米芯添加量在0.5 g時(shí)，木聚糖酶酶活顯著上升，當(dāng)玉米芯添加量在1.0 g時(shí)，木聚糖酶酶活仍繼續(xù)上升，而隨玉米芯添加量繼續(xù)增加，木聚糖酶酶活基本趨于穩(wěn)定。綜合考慮玉米芯添加量在1.0 g時(shí)，α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶三種酶活力可以達(dá)到酶活最優(yōu)化，此時(shí)，三種酶制劑的活力分別可以達(dá)到225、781、7656 IU/g。

2.1.3 魔芋粉添加量對固態(tài)混菌發(fā)酵復(fù)合酶生產(chǎn)的影響 大多數(shù)微生物的β-甘露聚糖酶是誘導(dǎo)酶，只有在培養(yǎng)基中含有β-甘露聚糖時(shí)才進(jìn)行β-甘露聚糖酶的合成。魔芋粉中含有44%～64%葡甘露聚糖，可以誘導(dǎo)β-甘露聚糖酶的生產(chǎn)，但對α-半乳糖苷酶和木聚糖酶的影響尚未考察。因此，根據(jù)2.1.1和2.1.2的結(jié)果，采用麩皮7 g，豆粕3 g，玉米芯粉1.0 g，其他因素不變，作為進(jìn)一步進(jìn)行研究的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，對混菌發(fā)酵培養(yǎng)基中魔芋粉的添加量對復(fù)合酶生產(chǎn)的影響進(jìn)行研究，結(jié)果見圖3。由圖3可見，混菌發(fā)酵培養(yǎng)基中添加魔芋粉，對黑曲霉α-半乳糖苷酶和木聚糖酶的酶活無顯著影響；而培養(yǎng)基中添加0.1 g魔芋粉與不添加魔芋粉相比，β-甘露聚糖酶酶活力顯著提高，但隨魔芋粉的添加量繼續(xù)增加β-甘露聚糖酶酶活基本趨于穩(wěn)定，因此在以麩皮與豆粕粉質(zhì)量為10 g為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，魔芋粉添加量為0.1 g，此時(shí)酶活力可以達(dá)到862 IU/g。

2.1.4 魚粉添加量對固態(tài)混菌發(fā)酵復(fù)合酶生產(chǎn)的影響 黑曲霉α-半乳糖苷酶的純菌發(fā)酵中，由于發(fā)酵結(jié)束之后，孢子數(shù)量多，在進(jìn)行磨粉處理時(shí)會造成孢子在空氣中揮散。經(jīng)過試驗(yàn)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的魚粉，可以在一定程度上抑制黑曲霉孢子的生長，但又不會造成α-半乳糖苷酶酶活的降低。因此，進(jìn)一步對混菌發(fā)酵培養(yǎng)基中魚粉的添加量對復(fù)合酶生產(chǎn)的影響進(jìn)行研究，結(jié)果見圖4。由圖4可見，混菌發(fā)酵培養(yǎng)基中添加魚粉，對α-半乳糖苷酶酶活沒有影響，但卻強(qiáng)烈抑制了β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的酶活，雖然發(fā)酵產(chǎn)品烘干后孢子數(shù)量減少，但也相應(yīng)降低了復(fù)合酶的酶活，由此可見，在黑曲霉混菌發(fā)酵進(jìn)行復(fù)合酶生產(chǎn)時(shí)，混菌發(fā)酵培養(yǎng)基中不需要添加魚粉。

2.1.5 無機(jī)氮源（NH4）2SO4和NaNO3對固態(tài)混菌發(fā)酵復(fù)合酶生產(chǎn)的影響 少量的NaNO3和（NH4）2SO4對黑曲霉木聚糖酶生產(chǎn)都有激活作用，而且NaNO3的誘導(dǎo)效果及其顯著；NaNO3和（NH4）2SO4對黑曲霉β-甘露聚糖酶的生產(chǎn)都有輕微的抑制作用；NaNO3對黑曲霉α-半乳糖苷酶的生產(chǎn)有抑制作用，而（NH4）2SO4對α-半乳糖苷酶的生產(chǎn)卻有激活作用 （許堯興等，2009）。通過試驗(yàn)，確定 NaNO3和（NH4）2SO4的最適添加濃度，使混菌發(fā)酵的復(fù)合酶酶活達(dá)到最優(yōu)化，結(jié)果見圖5和圖6。綜合考慮α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶三種酶活力，當(dāng)（NH4）2SO4添加量為

0.2 g，NaNO3添加量為0.1 g時(shí)，三種酶的酶活力可以得到最優(yōu)化，此時(shí)三種飼用酶活力分別可以達(dá)到 216、772、9244 IU/g。

綜合分析，黑曲霉混菌發(fā)酵生產(chǎn)飼用復(fù)合酶制劑的優(yōu)化培養(yǎng)基配方為 （以麩皮和豆粕總量為10 g）計(jì)算：麩皮 7.0 g，豆粕 3.0 g，玉米芯 1.0 g，魔 芋 粉 0.1 g， 葡 萄 糖 0.5 g， （NH4）2SO40.2 g，NaNO30.1 g，MgSO40.1g，KH2PO40.2 g，H2O 11 mL。以下的培養(yǎng)條件試驗(yàn)就是以優(yōu)化好的培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)。

2.2 培養(yǎng)條件對黑曲霉固態(tài)混菌發(fā)酵生產(chǎn)復(fù)合酶的影響 前期研究表明，黑曲霉菌株純菌發(fā)酵生產(chǎn)α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶時(shí)，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基含水量和裝載量條件是一致的，在培養(yǎng)溫度30℃時(shí)，當(dāng)固形物與加水比1∶1，300 mL三角瓶中裝量8 g培養(yǎng)基時(shí)各酶活達(dá)到最大值 （許堯興等，2009； 李艷麗等，2009；Xu等，2008）。因此，在研究培養(yǎng)條件對黑曲霉混菌發(fā)酵生產(chǎn)復(fù)合酶的影響時(shí)不予改變。

2.2.1 接種比例對固態(tài)混菌發(fā)酵復(fù)合酶生產(chǎn)的影響 純菌發(fā)酵時(shí)接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期，接種量小，延長菌體延遲期，發(fā)酵周期長，易染菌；但接種量過高往往又會使菌體生長過快，代謝產(chǎn)物積累過多，反而會抑制后期菌體的生長?；炀l(fā)酵進(jìn)行飼用復(fù)合酶生產(chǎn)時(shí)，不同的接種比例也會對復(fù)合酶制劑當(dāng)中單一酶的酶活產(chǎn)生影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知，不同接種比例對復(fù)合酶中α-半乳糖苷酶的酶活基本無影響；當(dāng)α∶β∶X 為 4∶5∶5時(shí)，β-甘露聚糖酶的酶活達(dá)到最高值883 IU/g，其次當(dāng) α∶β∶X 為 5∶6∶6 時(shí)，β-甘露聚糖酶的酶活可以達(dá)到 813 IU/g； 當(dāng) α∶β∶X 為 1∶2∶2時(shí)，木聚糖酶的酶活達(dá)到最高值9900 IU/g，其次當(dāng) α∶β∶X 為 5∶6∶6 時(shí)，木聚糖酶的酶活可以達(dá)到9767 IU/g。綜合考慮α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶三種酶活力，當(dāng) α∶β∶X 為 5∶6∶6 時(shí)，可以達(dá)到酶活最優(yōu)化，此時(shí)，三種酶制劑的活力分別可以達(dá)到 201、813、9767 IU/g。

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對混菌發(fā)酵復(fù)合酶生產(chǎn)的影響在獲得了混菌發(fā)酵復(fù)合酶生產(chǎn)菌株接種比例的基礎(chǔ)上，研究了不同培養(yǎng)時(shí)間對菌株合成飼用復(fù)合酶的影響。接種后從培養(yǎng)48 h起，每6 h取樣，測定不同培養(yǎng)時(shí)間的各單酶產(chǎn)量，結(jié)果見圖8。由圖8可見，在試驗(yàn)的時(shí)間范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，α-半乳糖苷酶的酶活呈不斷上升趨勢，其中78 h時(shí)的酶活比60 h時(shí)的酶活提高了20%；β-甘露聚糖酶酶活在60 h之后達(dá)到了穩(wěn)定；木聚糖酶則在60 h時(shí)達(dá)到第一個(gè)酶活高峰，此后隨著時(shí)間延長，木聚糖酶酶活先是下降，66 h之后酶活又呈上升趨勢，在72 h后酶活也達(dá)到了穩(wěn)定。雖然木聚糖酶酶活出現(xiàn)兩個(gè)產(chǎn)酶高峰，但第二個(gè)產(chǎn)酶高峰比第一個(gè)產(chǎn)酶高峰時(shí)間上延長了12 h以上，但單位酶活僅提高2%。綜合分析發(fā)酵效率和發(fā)酵產(chǎn)量，將菌株復(fù)合發(fā)酵生產(chǎn)復(fù)合酶的時(shí)間定為60 h，此時(shí)三種酶制劑的活力分別可以達(dá)到221、894、10188 IU/g。

綜合分析，黑曲霉混菌發(fā)酵生產(chǎn)飼用復(fù)合酶制劑的產(chǎn)酶最適培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度30℃，固形物與加水比為 1∶1，α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶接種比例為5∶6∶6，接種混合孢子懸浮液2.5 mL（以一支菌種斜面加30 mL無菌水為標(biāo)準(zhǔn)），300 mL三角瓶中裝量8 g培養(yǎng)基，發(fā)酵60 h時(shí)，復(fù)合酶產(chǎn)量達(dá)到最優(yōu)，α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶三種酶制劑的活力分別可以達(dá)到 221、894、10188 IU/g。

3 討論

混菌發(fā)酵指采用兩種或多種微生物的協(xié)同作用共同完成某發(fā)酵過程的一種新型發(fā)酵技術(shù)，是純種發(fā)酵技術(shù)的新發(fā)展，也是一種不需要進(jìn)行復(fù)雜的DNA體外重組就可取得類似效果的新型發(fā)酵技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是可提高發(fā)酵效率甚至可形成新產(chǎn)品，因此，得到了廣泛的應(yīng)用（方浩等，2009；胡奎娟等，2007）。本試驗(yàn)中的三株黑曲霉菌株，雖然具有相似的遺傳背景但卻具有不同的生產(chǎn)性狀，分別為α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶高產(chǎn)菌株，酶活分別可以達(dá)到245、1101、9478 IU/g。通過混菌發(fā)酵營養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件研究，通過單次混菌發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物中α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的酶活分別可以達(dá)到221、894、10188 IU/g。 與純菌發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵產(chǎn)品中相對單一酶來講，只有木聚糖酶酶活提高了7.50%，而α-半乳糖苷酶和β-甘露聚糖酶酶活分別比純菌發(fā)酵降低了9.80%和18.80%。目前，在飼料中添加復(fù)合酶制劑成為一個(gè)趨勢，但現(xiàn)在的復(fù)合酶一般是由單一酶復(fù)配而來的，提高了應(yīng)用的成本。從表觀上看，本次研究混菌發(fā)酵對試驗(yàn)的三種酶活的提高并沒有起到作用，但從復(fù)合酶角度來講，若想得到含有α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的復(fù)合酶制劑產(chǎn)品，勢必要對三種純菌發(fā)酵的酶制劑進(jìn)行復(fù)配，這樣復(fù)配產(chǎn)品的獲得一是需要進(jìn)行三次純菌發(fā)酵過程，二是通過復(fù)配之后（假設(shè)按 1∶1∶1進(jìn)行配制），復(fù)配產(chǎn)品中單一酶制劑比純菌發(fā)酵的酶制劑產(chǎn)品酶活要降低。對混菌發(fā)酵而言，復(fù)合酶產(chǎn)品只需要進(jìn)行一次發(fā)酵過程，而且發(fā)酵產(chǎn)品中不但木聚糖酶酶活比純菌發(fā)酵要提高，而且α-半乳糖苷酶和β-甘露聚糖酶酶活也只比純菌發(fā)酵降低了9.80%和18.77%，優(yōu)勢明顯。

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