東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院 鞏玉輝 于洪賢

黑龍江大學(xué)司法鑒定中心 馬玉堃＊

中國環(huán)境科學(xué)研究院 王海燕

水櫛霉是水體受到一定程度單、雙糖或蛋白質(zhì)污染的指示生物，是一種能在北方低溫氣候下生長(zhǎng)繁殖的水生絲狀真菌，菌體較大并能夠結(jié)成絮狀，其善于利用含糖有機(jī)污染物實(shí)現(xiàn)自身的物質(zhì)代謝，生長(zhǎng)和繁殖快速，無毒無害。本研究對(duì)水櫛霉的概略養(yǎng)分及氨基酸、脂肪酸、礦物質(zhì)元素成分進(jìn)行測(cè)定分析，旨為水櫛霉作為飼料資源的合理開發(fā)和利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株及其培養(yǎng) 水櫛霉菌株 （分離與牡丹江海浪河河夾大壩），保存于東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院水生生物實(shí)驗(yàn)室，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

PDA培養(yǎng)基（菌種活化用培養(yǎng)基）：馬鈴薯去皮200 g切成小塊，加水煮沸30 min，過濾，加18 g葡萄糖，用自來水定容至1000 mL。固體培養(yǎng)基則加入15 g的瓊脂，121℃，滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)基：淀粉2 g，NaNO33 g，K2HPO41 g，F(xiàn)eSO40.01 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，H2O 1 L；115℃，30 min滅菌。

查氏液體培養(yǎng)基：蔗糖 30 g，NaNO33 g，K2HPO41 g，F(xiàn)eSO40.01 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，H2O 1 L；115 ℃，30 min 滅菌。

優(yōu)化培養(yǎng)基：碳源，氮源，K2HPO41 g，F(xiàn)eSO40.01 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，H2O 1L；最適pH，115℃，30 min滅菌。

1.1.2 試劑與儀器 試劑：氯仿，甲醇，石油醚（60～90℃），乙醚，0.5 mL/LNaOH的甲醇溶液，0.5 moL/LNaOH，0.1 mol/L Tris HCL，硫酸，正已烷，鹽酸，葡萄糖，蒽酮。

儀器：Varian 450-GC 240-MS，超聲波清洗器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52，上海亞榮生化廠)，恒溫水浴鍋，冷凍干燥機(jī)（FD-1A-50，北京博醫(yī)實(shí)驗(yàn)儀器)，離心機(jī)（LD4-40，北京醫(yī)用公司），滅菌鍋（YXQ-LS-50S，上海博訊醫(yī)療廠），垂直流超凈工作臺(tái)（ZHJH-1109），搖床，氨基酸自動(dòng)分析儀（日立 L-8800），電子天平（ALC-210.4），生化培養(yǎng)箱（HPS-250），顯微鏡（cx31 奧林巴斯），分光光度計(jì)，微波消解裝置（功率為1 kW 的聚四氟乙烯型密閉消解容器），ICP發(fā)射光譜儀（美國PE公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水櫛霉的分離與培養(yǎng) 挑取待分離的黏稠絮狀物于75%乙醇中稍加浸泡，除去表面附著的其他微生物，放入100 mL含玻璃珠的無菌水中，搖床振蕩30 min左右直至絮狀物破碎，制成菌懸液，用無菌移液管從中吸取1 mL菌懸液移入裝有9 mL無菌水的試管內(nèi)，得到10-1梯度的菌懸液，按上述方法制備10-1～10-7梯度的菌懸液。分別用無菌移液管吸取1 mL不同梯度的菌懸液移入無菌平皿，然后倒入45℃的PDA培養(yǎng)基（適合霉菌類真菌生長(zhǎng)）15 mL，迅速混勻成為平板培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后倒置平板，放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

挑取少量鏡檢結(jié)果吻合的目標(biāo)菌落于事先制好的PDA平板上劃線，劃線時(shí)要在所劃的范圍內(nèi)盡量劃滿，然后將接種環(huán)灼燒，再轉(zhuǎn)動(dòng)一定的角度連接已劃線的區(qū)域再劃另一區(qū)，最后劃滿整個(gè)平板培養(yǎng)后得到單菌落，重復(fù)多次平板劃線最終得到純菌，轉(zhuǎn)斜面?zhèn)溆?。在挑取單菌落時(shí)應(yīng)注意最好選擇單獨(dú)的菌落，并應(yīng)在菌落邊緣挑取少量菌體，盡量不要帶入原來的基質(zhì)，劃線時(shí)不要?jiǎng)澠骗傊砻?，整個(gè)過程均應(yīng)無菌操作。

將分離純化的水櫛霉菌體接種于種子液中，30℃、140 r/min搖24 h制成種子液。以10%的接種量加入優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，30℃、140 r/min培養(yǎng)48 h得到最大菌體量。

1.2.2 概略養(yǎng)分的測(cè)定方法 水分測(cè)定：GB/T 5009.03-2003； 粗蛋白質(zhì)：GB/T 5009.05-2003；粗脂肪：GB/T 14772-2003； 粗纖維：GB/T 5009.10-2003。

1.2.3 氨基酸測(cè)定 氨基酸：GB/T 5009.124-2003，日立 L～8800型氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.2.4 脂肪酸的測(cè)定 氫氧化鉀/甲醇?jí)A催化甲酯化法：取粗脂肪樣品50 μL至50 mL燒瓶中，加入正己烷+乙醚 （2∶1，V/V）5 mL，0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液3 mL，60℃恒溫回流酯化反應(yīng)20 min。加水 10 mL，搖勻，超聲處理 1 min，取出移至離心管中，4000 r/min離心2 min，吸取上層脂肪酸甲酯，做 GC/MS分析（鄭敏燕等，2010）。

1.2.5 礦質(zhì)元素的測(cè)點(diǎn) 用 HNO3+HClO4（3∶1，V∶V）混合酸作為消解劑進(jìn)行樣品消化，利用電感耦合等離子發(fā)射光譜法進(jìn)行測(cè)定 （趙清華等，2006）。

2 結(jié)果與討論

2.1 概略養(yǎng)分分析 由表1可見，烘干后的水櫛霉中總糖含量高達(dá)61.69%，粗蛋白質(zhì)含量較高為29.33%，粗纖維含量較低為10.06%。由此可見，水櫛霉是一種營養(yǎng)豐富的水生真菌，可作為動(dòng)物飼料較好的能量和蛋白質(zhì)的來源。

表1 水櫛霉的概略養(yǎng)分分析結(jié)果 %

2.2 氨基酸分析 由表2可見，水櫛霉中含有17種氨基酸，總氨基酸含量為15.73%，必需氨基酸含量為6.69%，含有生豬生長(zhǎng)的9種必需氨基酸，并且生豬生長(zhǎng)的第一限制性氨基酸賴氨酸的含量達(dá)到1.51%，比李如敏（1992）報(bào)道的生豬理想需要量高8.1個(gè)百分點(diǎn)。因此水櫛霉作為新的菌類飼料，完全可以滿足動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的需求。

2.3 脂肪酸分析 采用φ（硫酸）=1的甲醇溶液酯化法對(duì)脂肪酸衍生化后，經(jīng)過GC-MS分析，水櫛霉的脂肪酸含量見表3。由表3可見，水櫛霉的主要脂肪酸成分是十六烷酸、十八碳二烯酸、油酸、十八烯酸，其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為17.24%、12.43%、20.67%、24.12%；其中不飽和脂肪酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為67.98%。水櫛霉中還含有動(dòng)物生長(zhǎng)所必需的氨基酸,如花生四烯酸 （相對(duì)含量1.92%）、十八碳二烯酸（相對(duì)含量12.43%）。

表2 水櫛霉的氨基酸含量表 %

2.4 礦物質(zhì)元素分析 結(jié)果見表4。水櫛霉中含有動(dòng)物生長(zhǎng)的多種必需礦物質(zhì)元素，其中鉀、鈣、鋅含量分別為753、546、900 mg/kg。

表3 水櫛霉的脂肪酸含量

表4 水櫛霉礦質(zhì)元素分析 mg/kg

3 小結(jié)

水櫛霉菌體營養(yǎng)物質(zhì)豐富，含有較高的糖類（61.69%）、粗蛋白質(zhì)（29.33%），以及動(dòng)物生長(zhǎng)的氨基酸、脂肪酸、礦物質(zhì)元素。另外，水櫛霉具有低溫快速生長(zhǎng)、自身營養(yǎng)豐富、能夠利用生產(chǎn)廢水的特點(diǎn)。因此對(duì)水櫛霉的開發(fā)利用將具有廣闊的市場(chǎng)前景。

[1]李如敏.實(shí)用養(yǎng)豬學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1992.210～215.

[2]鄭敏燕，寧建剛，耿薇，等.兩種不同酯化方法分析櫻桃仁中的脂肪酸成分[J].應(yīng)用化工，2010，1：133 ～ 135.

[3]趙清華，李英姿，劉莉，等.微波消解技術(shù)與ICP～AES法測(cè)定水中金屬元素[J].給水排水，2006，6：46 ～ 47.