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        多克隆同步篩選及驗證胰腺癌肺轉(zhuǎn)移細胞亞群

        2012-06-28 12:56:34田文嘉杜洪震卞曉翠李開龍
        中國老年學(xué)雜志 2012年10期
        關(guān)鍵詞:培養(yǎng)皿原代亞群

        田文嘉 杜洪震 卞曉翠 李開龍

        (中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院病理學(xué)系,北京 100005)

        胰腺癌是消化道系統(tǒng)預(yù)后最差的惡性腫瘤之一,轉(zhuǎn)移是胰腺癌患者死亡的主要原因之一〔1,2〕?,F(xiàn)有研究表明,在胰腺癌發(fā)生和發(fā)展過程中有多個基因突變,包括12個關(guān)鍵的信號傳導(dǎo)途徑,如TGF-β信號途徑、鳥嘌呤三磷酸酶(GTPase)依賴的信號途徑、Wnt/Notch信號途徑和JNK信號途徑等〔3〕,說明胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是多基因、多信號途徑參與的復(fù)雜的生物過程。因此,發(fā)現(xiàn)和驗證與胰腺癌轉(zhuǎn)移有因果關(guān)系的基因和信號途徑對胰腺癌的診斷和治療有重要意義。本實驗結(jié)合全基因組基因突變技術(shù)和小鼠功能篩選,利用多克隆同步篩選和驗證胰腺癌肺轉(zhuǎn)移細胞亞群,從而得到與胰腺癌轉(zhuǎn)移有高度關(guān)聯(lián)的基因。

        1 材料與方法

        1.1 胰腺癌肺轉(zhuǎn)移細胞亞群篩選前期基礎(chǔ) 本實驗室前期工作已經(jīng)采用全基因組隨機基因敲除技術(shù)平臺 (RHKO)在人類胰腺癌細胞株AsPC-1建立了全基因組隨機突變文庫。RHKO的原理是通過能在真核細胞中高效整合的piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建基因搜尋載體 (Gene Search Vector,GSV),并將其隨機插入基因組中,造成全基因組范圍內(nèi)的隨機基因突變。在轉(zhuǎn)錄激活因子tTA的作用下,GSV中的TRE反應(yīng)元件被激活,進而啟動附近基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄激活子tTA與TRE的結(jié)合還受到強力霉素 (Doxycycline,DOX)的調(diào)控,通過添加或者不添加DOX能夠?qū)崿F(xiàn)人為控制tTA是否激活TRE而啟動附近基因的轉(zhuǎn)錄。此外,GSV中還包含新霉素抗性基因,使轉(zhuǎn)入GSV的真核細胞可以利用G418篩選陽性克隆。利用這一技術(shù)建立了一個含約110萬隨機基因的突變文庫,進而通過裸鼠轉(zhuǎn)移模型篩選具有肺轉(zhuǎn)移特性的AsPC-1細胞亞群,初步篩選和原代培養(yǎng)得到45個肺轉(zhuǎn)移細胞克隆,利用Splinkette PCR的方法從具有高轉(zhuǎn)移特性的細胞株中克隆GSV插入位點,從中得到16個候選基因。

        1.2 細胞培養(yǎng) AsPC-1細胞培養(yǎng)采用HyClone公司的DMEM高糖培養(yǎng)基,加入10%的胎牛血清和100 U/ml的青霉素以及0.1 mg/ml鏈霉素。45個高轉(zhuǎn)移的AsPC-1細胞克隆M1,M2,M3……M45分別培養(yǎng)至對數(shù)生長期,各取1×105個細胞混合至15 cm的培養(yǎng)皿中,放于含有5%CO2的37℃恒溫孵箱中,待細胞生長至對數(shù)生長期,胰酶消化、離心、收集細胞,PBS漂洗2次,離心后重懸并計數(shù)細胞,1×106個細胞/只,采用尾靜脈注射的方式注射到兩組裸鼠體內(nèi)。

        1.3 動物 SPF級別4~6周齡雌性裸鼠(BALB/C nu/nu),使用前裸鼠適應(yīng)動物房的環(huán)境1 w,減少外界環(huán)境對實驗的影響。實驗動物分為加入強力霉素(+Dox)和不加強力霉素(-Dox)兩組,每組8只。+Dox組動物的飲水中加入強力霉素(終濃度為200μg/ml),由于強力霉素在光照條件下容易分解,所以+Dox組動物的飲水器用錫箔紙包裹以遮蔽光線。

        1.4 原代培養(yǎng) 一旦裸鼠出現(xiàn)病態(tài)體征,如:行動緩慢、呼吸異常、體形消瘦、神情低迷、反應(yīng)性差等,立即處死,碘酒消毒,在通風(fēng)櫥內(nèi)取出肺臟(圖1)。在玻璃皿內(nèi)用PBS清洗數(shù)次以盡可能洗去血漬。用手術(shù)刀將肺組織切碎,用含有600μg/ml G418(CALBIO-CHEM)的DMEM培養(yǎng)基懸浮碎塊至20 ml離心管,1 200 r/min離心5 min后,棄上清,加入15 ml紅細胞裂解液,重懸組織碎塊,靜置裂解紅細胞10 min。1 200 r/min離心5 min,棄上清,用PBS清洗并1 200 r/min離心5 min,棄去上清后用培養(yǎng)基重懸組織碎塊,并將其轉(zhuǎn)移至10 cm培養(yǎng)皿中。第二天更換培養(yǎng)基,去除未貼壁的懸浮組織碎塊,并加入新鮮培養(yǎng)基。5 d后,加入G418篩選轉(zhuǎn)移到肺組織的AsPC-1細胞。3~5 d換1次液并加入G418,大約2 w后,培養(yǎng)皿內(nèi)可見散在的AsPC-1細胞克隆,消化后擴大培養(yǎng)。每只裸鼠的肺臟用兩個10 cm的培養(yǎng)皿分別培養(yǎng),一個培養(yǎng)皿用于細胞凍存,另一個培養(yǎng)皿用于基因組DNA的提取。細胞培養(yǎng)于含有5%CO2的37℃恒溫孵箱中。

        1.5 提取基因組DNA 待細胞生長至對數(shù)生長期,PBS漂洗2次,根據(jù)威格拉斯基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。提取基因組DNA后,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA,同時利用紫外分光光度計測定DNA的濃度和純度。

        1.6 基因組PCR 根據(jù)高轉(zhuǎn)移性細胞株中GSV插入位點的測序結(jié)果和GSV的序列結(jié)構(gòu),設(shè)計基因的引物。引物序列設(shè)計如下:SQSTM1:5'CCT GAA GCT CTA CAA ACA AGG AAT ATT TCA 3',PB:5'TTT TACGCA TGA TTA TCT TTA ACGTAC GTC 3',反應(yīng)產(chǎn)物長度SQSTM1為525 bp,1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增DNA片段。

        2 結(jié)果

        前期大規(guī)模篩選得到45個AsPC-1人胰腺癌肺轉(zhuǎn)移細胞亞群,為進一步篩選和驗證具有肺轉(zhuǎn)移能力的細胞亞群,從每個細胞亞群各取105細胞混合形成混合細胞亞群庫?;旌蠋旒毎謩e尾靜脈接種兩組小鼠:一組飲用水中加強力霉素,另一組飲用水中不加強力霉素。50~73 d后,分別取每只小鼠肺進行原代培養(yǎng)得到具有肺轉(zhuǎn)移能力的胰腺癌細胞亞群(圖1,圖2),共得到16個細胞亞群,每組得到8個細胞亞群。體內(nèi)多克隆篩選和原代培養(yǎng),加強力霉素組培養(yǎng)出較多的細胞克隆,而不加強力霉素組培養(yǎng)出的細胞克隆數(shù)較少。利用16對特異基因定位DNA引物PCR分析了16個細胞亞群。PCR分析結(jié)果顯示+Dox組,肺轉(zhuǎn)移原代培養(yǎng)有3只小鼠檢測到 SQSTM1基因細胞亞群 (37.5%),而-Dox組有6只小鼠檢測到SQSTM1基因細胞亞群 (75.0%,圖3)。PCR分析SEMA4B,UBE2K和GNA13基因在16只小鼠都為陰性。檢測表明,強力霉素介導(dǎo)的SQSTM1基因表達能導(dǎo)致不同的胰腺癌肺轉(zhuǎn)移能力。

        圖1 +Dox組和-Dox組裸鼠的生存曲線

        圖2 +Dox組和-Dox組裸鼠的肺臟

        圖3 +Dox組和-Dox組裸鼠中SQSTM1表達情況

        3 討論

        目前,胰腺癌的臨床治療手段主要是早期手術(shù)切除加術(shù)后放、化療,針對胰腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移特性的多種藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床治療,在一定程度上改善了胰腺癌病人的生存質(zhì)量和預(yù)后,但胰腺癌的死亡率依然沒有明顯改善。腫瘤轉(zhuǎn)移是胰腺癌病人的主要死亡原因,因此,找出控制胰腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因就顯得尤為重要。

        本實驗選用分化好、惡性程度相對低的AsPC-1人胰腺癌細胞系為研究對象,采用全基因組隨機基因敲除技術(shù)平臺〔4〕的方法,尋找將低轉(zhuǎn)移性AsPC-1細胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦咿D(zhuǎn)移細胞的關(guān)鍵基因,以期為臨床上早期診斷、早期治療提供新的作用靶點。

        在本實驗室前期工作篩選得到的16個候選基因的基礎(chǔ)上,本研究利用裸鼠體內(nèi)篩選和基因組 PCR的方法,篩選出SQSTM1是在胰腺癌肺轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵基因之一。多項研究表明SQSTM1具有調(diào)控細胞多種功能的作用。SQSTM1能夠通過抑制有絲分裂信號傳導(dǎo)而阻礙脂肪細胞的分化,能夠通過控制破骨細胞的生成而調(diào)節(jié)骨的重塑〔4,5〕。SQSTM1能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)生長因子受體內(nèi)部化、蛋白定位以及通過調(diào)節(jié)NF-κB途徑而在Ras誘導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)化中起一定的作用〔6,7〕。SQSTM1還具有調(diào)節(jié)細胞耗氧量以及下調(diào)胞外調(diào)控激酶(ERK-1/2)磷酸化的作用〔5〕。然而,SQSTM1在胰腺癌肺轉(zhuǎn)移過程中的詳細機制,以及這個基因在其他腫瘤轉(zhuǎn)移中是否也起到相同的關(guān)鍵作用,需要進一步的研究。

        1 Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics〔J〕.CA Cancer JClin,2009;59:225-49.

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        6 Geetha T,Jiang J,Wooten MW.Lysine63 polyubiquitination of the nerve growth factor receptor TrkA directs internalization and signaling〔J〕.Mol Cell,2005;20:301-12.

        7 Duran A,Linares JF,Galvez AS,et al.The signaling adaptor p62 is an important NF-kappaB mediator in tumorigenesis〔J〕.Cancer Cell,2008;13:343-54.

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