李中南，李莉，陳光亮，汪俊

(1.安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230031;2.安徽中醫(yī)學(xué)院藥理室)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平的提高，糖尿病合并痛風(fēng)發(fā)病率逐年增高，共同構(gòu)成了心血管疾病的危險(xiǎn)因素。有資料顯示，重度胰島素抵抗，胰島B細(xì)胞分泌功能障礙，明顯增加了糖代謝異常，是糖尿病合并痛風(fēng)的主要代謝特征，而炎癥因子、內(nèi)皮細(xì)胞損傷貫穿兩病的始終。過(guò)高的血尿酸可損害胰島素B細(xì)胞誘發(fā)糖尿病已成為事實(shí)。二病并存，互為關(guān)聯(lián)，互為影響，使得病情進(jìn)展加速［1-2］。如何控制炎癥因子，減少內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，通過(guò)多種途徑，保護(hù)腎臟、血管，減少并發(fā)癥是我們研究的新課題。本實(shí)驗(yàn)選擇了安徽省中醫(yī)院名老中醫(yī)王正雨治療痛風(fēng)的經(jīng)驗(yàn)方萆苓方，通過(guò)對(duì)大鼠糖尿病痛風(fēng)模型的作用，觀察中藥對(duì)模型大鼠內(nèi)皮細(xì)胞的影響，分析萆苓方降糖降尿酸的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠70只，四周齡，平均體質(zhì)量(230±20)g。

1.1.2 藥品及試劑 萆苓祛痛方，由安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑中心提供;吲哚美辛，上海辛帕斯制藥有限公司，批號(hào):090301;二甲雙胍，天津太平洋制藥有限公司，批號(hào):100604;鏈脲佐菌素(STZ)，美國(guó)Sigma公司，批號(hào):s013020100109544;尿酸，美國(guó)Sigma公司，批號(hào):058k0722;檸檬酸、檸檬酸鈉(國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?;大鼠ET-1試劑盒，美國(guó)sigma公司生產(chǎn)批號(hào):BPE10326R;大鼠NO試劑盒，南京建成生物工程研究所批號(hào):20101027。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 美國(guó)強(qiáng)生穩(wěn)豪型微量血糖儀(One Touch Utra1)及配套血糖試紙;BS224S電子天平;LXJ2I型離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠);Bio—Rad 550酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio.Rad公司;Thermo Labsystems WeLLwash 4MK2全自動(dòng)洗板機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件 室溫20～30℃，濕度55% ～65%，空調(diào)控制。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 制備糖尿病大鼠模型［3-4］取大鼠70只，我院動(dòng)物中心飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度保持在25℃左右，濕度在5O%左右。明暗周期12h，自由飲水和進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，測(cè)體質(zhì)量，大鼠體質(zhì)量在230 g左右。根據(jù)體質(zhì)量分層后進(jìn)行隨機(jī)分組:健康對(duì)照組10只，模型組10只，萆苓祛痛方大、中、小組各10只，吲哚美辛組10只，二甲雙胍組10只。造模前禁食12h(不禁水)測(cè)血糖1次。

新鮮配制pH4.5的檸檬酸緩沖液(用檸檬酸和檸檬酸三鈉按一定比例配制)，4～8℃ 冷藏保存。臨用前將鏈脲佐菌素(STZ)配制成2%濃度的溶液，模型組、藥物組按40 mg/kg，1 ml/100 g，單次腹腔注射此溶液1次，健康對(duì)照組折算出等量的檸檬酸緩沖液注射1次。

72 h后測(cè)大鼠空腹尾靜脈血。以空腹血糖≥13.8 mmol/L作為糖尿病成模的標(biāo)準(zhǔn)。觀察各組大鼠造模后進(jìn)食、飲水量，大鼠精神狀態(tài)、形體、毛色。造模成功后根據(jù)分組給藥，連續(xù)灌胃9 d。

1.4.2 制備痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎模型［5］制備尿酸鈉結(jié)晶:194 ml蒸餾水加6 ml NaOH，煮沸加1 g尿酸，用稀鹽酸調(diào)pH7.2，攪拌冷卻，4℃冰箱保存24 h，去上清液，用濾紙將沉淀物水分吸干，放入干燥箱70℃烘2 h，取出，刮下粉末，放人研缽內(nèi)研成細(xì)末，用孔徑250μm的金屬網(wǎng)篩，過(guò)篩，裝瓶備用。用時(shí)取250 mg尿酸鈉結(jié)晶加45 ml0.9%氯化鈉注射溶液，再加5 ml吐溫80，加熱攪拌配成50 g/L尿酸鈉溶液。

取大鼠70只，根據(jù)上述分組稱重編號(hào)，痛風(fēng)模型前4 d，模型組每日灌胃等體積的0.9%氯化鈉注射溶液，其他動(dòng)物根據(jù)人用量與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用量的換算公式，計(jì)算出每只大鼠每次給藥量，萆苓祛痛方大、中、小組大鼠分別按 8 g/kg、4 g/kg、2 g/kg，吲哚美辛組大鼠按 10 g/kg，二甲雙胍組大鼠按50 mg/kg，給藥劑量皆為1 ml/1 g/100 g灌胃給藥，每天1次，連續(xù)灌胃4 d。

第4天除正常組外，每只實(shí)驗(yàn)鼠均選右踝關(guān)節(jié)外側(cè)后方為穿刺點(diǎn)，針口斜面朝前上方與脛骨成45°夾角穿入踝關(guān)節(jié)腔，以4號(hào)針頭向關(guān)節(jié)腔注入0.2 ml尿酸鈉溶液，以關(guān)節(jié)囊對(duì)側(cè)鼓起為注入標(biāo)準(zhǔn)，誘導(dǎo)痛風(fēng)模型。模型成功后繼續(xù)灌胃5 d。末次給藥后2h處死大鼠，腹主動(dòng)脈抽血5 ml，加入試管，3 000 r/min離心10 min，分離血清，測(cè)定血尿酸、血糖值以及ET-1、NO并進(jìn)行組間差異性比較。

1.4.3 測(cè)定大鼠血糖、血尿酸、ET-1、NO 數(shù)值，由本院生化實(shí)驗(yàn)室完成。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)在SPSS13.0軟件上進(jìn)行，組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠血糖、血尿酸的影響 模型組、藥物組用藥前血糖均顯著高于正常組(P＜0.01)，提示糖尿病模型成功。與療前比較，萆苓方高、中、低組、二甲雙胍組均能顯著降低血糖，但萆苓方作用弱于二甲雙胍組。結(jié)果還顯示萆苓方各組均能顯著降低血尿酸，與模型組比較療效十分顯著(P＜0.01)，優(yōu)于吲哚美辛組，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血糖、血尿酸的比較()

表1 各組大鼠血糖、血尿酸的比較()

注:與模型組比較，a P ＜0.01，c P ＜0.05;與療前組比較，b P ＜0.05

組別 鼠數(shù)(只)療前空腹血糖(mmol/L)療后空腹血糖(mmol/L)血尿酸(μmol/L)10 5.50 ±1.46 5.80 ±1.68 38.33 ±14.84模型組 10 16.32 ±2.42 14.91 ±3.26 68.50 ±21.36萆苓方(高)10 17.27 ±2.03 10.10 ±1.13ab 44.12 ±14.64a萆苓方(中)10 16.32 ±2.29 11.37 ±1.85ab 51.14 ±18.90a萆苓方(低)10 16.83 ±1.79 12.73 ±2.17bc 47.12 ±20.44a二甲雙胍 10 17.62 ±2.52 9.28 ±2.28ab 60.11 ±8.60吲哚美辛 10 17.85 ±3.29 14.60 ±3.25 52.5 ±8.89正常組a

2.2 對(duì)大鼠ET-T、NO的影響 造模后大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重受損，ET-1數(shù)值明顯升高，灌胃萆苓方后(高、中劑量組)，ET-1指標(biāo)下降(P＜0.05)。二甲雙胍、吲哚美辛組數(shù)值仍升高。提示萆苓方對(duì)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞有良好的保護(hù)作用，萆苓方藥物劑量與療效具有相關(guān)性，高、中組療效較為突出。動(dòng)物造模后一氧化氮水平降低，灌胃萆苓方后，高、中、低各組的NO明顯升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。表明萆苓方有提高一氧化氮水平的作用，但療效不及吲哚美辛組，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠ET-T、NO的比較()

表2 各組大鼠ET-T、NO的比較()

注:與模型組比較，a P ＜0.05，b P ＜0.01;與吲哚美辛組比較，c P ＜0.05，d P ＜0.01

組別 例數(shù) ET-1(ng/L) NO(μmol/L)10 9.51 ±3.38 8.06 ±4.85模型組 10 11.09 ±3.67 4.71 ±2.49萆苓方(高) 10 9.14 ±2.63a 14.75 ±4.13bc萆苓方(中) 10 9.45 ±4.14a 10.05 ±3.5bd萆苓方(低) 10 12.62 ±3.07 10.12 ±2.48bd二甲雙胍 10 12.54 ±3.01 13.51 ±5.84b吲哚美辛 10 13.46 ±3.82 18.16 ±5.83正常組b

3 討論

糖尿病和痛風(fēng)均為代謝性疾病，也是當(dāng)今危害人們健康的常見(jiàn)內(nèi)分泌疾病。糖尿病常伴有高血壓、高血脂、肥胖、高尿酸血癥等，而高尿酸血癥是痛風(fēng)發(fā)作的重要生化基礎(chǔ)。肥胖、血脂紊亂、糖耐量受損、胰島素抵抗等代謝綜合征組成部分的同時(shí)出現(xiàn)，往往是2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素［6-7］。我們選擇了痹苓方治療糖尿病合并痛風(fēng)，該方有60多年的臨床實(shí)踐，有一定的藥理藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)［5，8］，以清熱瀉濁，解毒活血立法。方中土茯苓、萆解、澤瀉、苡仁利濕瀉濁;黃柏、蒼術(shù)、虎杖清熱燥濕解毒;威靈仙祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、止疼痛;當(dāng)歸與牛膝、虎杖合用有活血定痛、利尿通淋之效。共奏瀉濁解毒，活血通絡(luò)之功。本次實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)觀察了萆苓方對(duì)模型大鼠內(nèi)皮細(xì)胞的影響及對(duì)血糖、血尿酸的作用。

3.1 對(duì)血糖、血尿酸的影響 越來(lái)越多的研究支持2型糖尿病是一種慢性低度炎癥狀態(tài)的假說(shuō)。有研究報(bào)道，2型糖尿病常伴有多種炎癥因子濃度的升高，炎癥標(biāo)志物能夠預(yù)測(cè)2型糖尿病的發(fā)生。有人通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了2型糖尿病患者CRP、IL-6等炎癥因子水平較健康對(duì)照組明顯升高，亦有實(shí)驗(yàn)證明抗炎治療可明顯改善2型糖尿病患者糖代謝異常。英國(guó)前瞻性糖尿病研究證實(shí)，二甲雙胍可能有降低血漿CRP的水平，減少氧化應(yīng)激，改善血管內(nèi)皮功能的作用［9-11］。我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。表1提示模型動(dòng)物予萆苓方后，高中劑量組的空腹血糖較前明顯下降(P＜0.01)，但療效弱于雙胍組(P＜0.05)。證實(shí)萆苓方可能通過(guò)抑制炎癥滲出降低動(dòng)物的血糖水平。結(jié)果還提示，動(dòng)物灌胃萆苓方后，高、中、低組的血尿酸水平明顯下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說(shuō)明萆苓方降低血尿酸的療效確切。分析其作用機(jī)制，可能是通過(guò)抑制炎癥因子急時(shí)相反應(yīng)，加速尿酸排泄而發(fā)揮作用的。

3.2 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞(ET-1)的作用 ET是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的內(nèi)源性縮血管物質(zhì)，具有收縮血管，促使血管平滑肌增殖的作用，其與NO是一對(duì)拮抗因子［12］。眾所周知炎癥引起內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常，可能會(huì)導(dǎo)致胰島素在組織細(xì)胞中的運(yùn)轉(zhuǎn)障礙而促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)生。高尿酸血癥易引起血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致或加重動(dòng)脈粥樣硬化。本文結(jié)果顯示，動(dòng)物模型組血漿ET-1水平明顯高于對(duì)照組，提示糖尿病痛風(fēng)可造成血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。結(jié)果還報(bào)告，血尿酸水平與ET活性存在正相關(guān)性，予萆苓方后，高、中劑量組的ET-1水平下降，證實(shí)本方對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，高、中劑量組較為明顯。其病理機(jī)制推測(cè)可能與下列因素相關(guān):①尿酸鹽結(jié)晶作為致炎因子可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，使內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放ET-1增加，造成血漿中的ET活性增加。②研究還表明，尿酸在體外增加血小板聚集，而且尿酸鹽結(jié)晶可激活血小板，使血小板活性增加，活化的血小板釋放PAI-1增加，使血漿PAI-1活性進(jìn)一步增高。③尿酸的產(chǎn)生與糖酵解有關(guān)，糖酵解由胰島素控制，在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，糖酵解過(guò)程中的中間產(chǎn)物向5-磷酸核糖及磷酸核糖磷酸轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致血尿酸生成隨之增多，而高胰島素血癥本身也可引起ET釋放增加，從而形成惡性循環(huán)［13］。

3.3 對(duì)一氧化氮的影響 一氧化氮 (NO)是具有舒張血管，松弛血管平滑肌和抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的物質(zhì)，對(duì)糖尿病患者發(fā)病有明顯影響。NO水平高低在一定程度上反映了糖尿病血管損傷的程度，NO低的糖尿病患者合并高尿酸血癥的發(fā)病率及危險(xiǎn)性都高。研究還發(fā)現(xiàn)一氧化氮可通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶的活性而抑制尿酸水平。NO的基礎(chǔ)水平取決于內(nèi)皮型一氧化氮和酶基因［14］。糖尿病合并痛風(fēng)，可以促進(jìn)血小板活化粘附，啟動(dòng)血凝過(guò)程，促進(jìn)血凝，并沉積于小動(dòng)脈壁，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，降低內(nèi)皮NO釋放，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂及血管平滑肌細(xì)胞增殖，加速血管病變和糖耐量異常的發(fā)生發(fā)展［15-16］。我們?cè)谘芯恐凶⒁獾侥Ｐ秃蟠笫蟮腘O水平顯著降低，予萆苓方后各組的NO明顯升高，表明痹苓方有提升一氧化氮水平，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

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