尹磊淼,魏穎,王宇,冉君,劉曉燕,徐玉東,楊永清

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Tricine電泳優(yōu)化方法在針灸效應(yīng)小分子蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用

尹磊淼1,魏穎2,王宇1,冉君2,劉曉燕2,徐玉東1,楊永清2

(1.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030;2.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203)

改進(jìn)一種適合分離、鑒定針灸效應(yīng)小分子蛋白的Tricine-SDS-PAGE電泳體系。研究調(diào)整分離膠中聚丙烯酰胺濃度和凝膠交聯(lián)度并加入適量甘油,從而優(yōu)化Tricine電泳系統(tǒng)。與常規(guī)Glycine-SDS-PAGE電泳系統(tǒng)比較,分離膠聚丙烯酰胺濃度為l6.8%、交聯(lián)度為5.8%、含10.4%甘油的Tricine-SDS-PAGE電泳明顯減少10 kD分子量蛋白的彌散,成功分離了分子量為11.0 kD的S100A8和11.8 kD的S100A11等兩個(gè)針刺抗哮喘小分子蛋白。優(yōu)化的Tricine-SDS-PAGE電泳系統(tǒng)可有效分離針灸效應(yīng)小分子蛋白。

針灸效應(yīng);物質(zhì)基礎(chǔ)研究;Tricine電泳;小分子蛋白

作為生命科學(xué)的分支之一,針灸學(xué)和分子生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等學(xué)科相互交叉,相互推動(dòng),產(chǎn)生了針灸效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究等一系列新的研究方向和領(lǐng)域[1,2]。針灸效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究立足于生命現(xiàn)象的本質(zhì),研究不同針灸效應(yīng)的響應(yīng)基因和應(yīng)答蛋白,闡釋相應(yīng)的針灸效應(yīng)生物學(xué)機(jī)制。這對(duì)保持我國(guó)在針灸研究領(lǐng)域的國(guó)際領(lǐng)先地位,率先在針灸研究領(lǐng)域擁有原創(chuàng)性的自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)具有重要的戰(zhàn)略意義[3]。針灸效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究常用技術(shù)手段有高效液相色譜[4],蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù),基因芯片、基因表達(dá)連續(xù)分析(serial analysis of gene expression,SAGE)技術(shù)[5]等。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)因操作簡(jiǎn)便,測(cè)定快速,重復(fù)性好,上樣量少等特點(diǎn)在針刺效應(yīng)蛋白質(zhì)的分離、分析、純化、鑒定等實(shí)驗(yàn)中具有廣泛的用途。SDS-PAGE電泳系統(tǒng)的有效分離范圍取決于聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度,并受尿素、甘油或蔗糖等可降低聚丙烯酰胺凝膠孔徑的溶質(zhì)分子影響;其次,調(diào)整和選擇電泳緩沖液中拖尾離子的種類和濃度,也可以達(dá)到改善小分子蛋白質(zhì)和多肽的分離效果[6,7]。

在前期研究中,我們課題組利用SAGE技術(shù)相繼發(fā)現(xiàn)了雙特異性磷酸酶1(DUSP-1)、金屬硫蛋白-2 (MT-2)、S100鈣結(jié)合蛋白A8(S100A8)和S100A11等一系列針刺抗哮喘效應(yīng)蛋白[8]。然而MT-2、S100A8、S100A11等蛋白分子量較小,利用普通SDS-PAGE電泳常常難以獲得較好的觀察和分析結(jié)果。本研究擬調(diào)整聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度,并適量增加甘油降低凝膠孔徑,采用三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)作為拖尾離子,利用快速考馬斯亮藍(lán)染色方法,嘗試建立了一種滿足小分子量蛋白檢測(cè)需要的電泳方法,從而配合其他分子生物學(xué)技術(shù)的開展,并為深入開展針灸效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

丙烯酰銨、甲叉雙丙烯酰銨(Bis-Acrylamide)、過硫酸銨(APS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)等均購自美國(guó)Bio-Rad公司;Tricine、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自美國(guó)Amresco公司;甘油、鹽酸(HCL)購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;溴酚藍(lán)購自上海升正生物技術(shù)有限公司;GelCode Blue Stain染色試劑購自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。pHS-3TC(0.01級(jí))精密數(shù)顯pH計(jì)購自上海天達(dá)儀器有限公司;小型垂直電泳槽、Gel-Doc凝膠成像系統(tǒng)購自美國(guó)Bio-Rad公司;蛋白質(zhì)分子量Marker購自MBI Fermentas公司。S100A8和S100A11蛋白由前期課題組通過基因表達(dá)和蛋白分離純化技術(shù)所得。

1.2 溶液配制

1.2.1 凝膠儲(chǔ)備液的配制

本研究中的Tricine電泳系統(tǒng)中共有兩種不同濃度和交聯(lián)度的凝膠貯存液,按配制稱取不同重量的丙烯酰銨和甲叉雙丙烯酰銨,將其溶于100 mL雙蒸水,混勻,4℃保存。詳見表1。

表1 Tricine-SDS-PAGE電泳凝膠儲(chǔ)備液的配制

1.2.2 電泳緩沖液的配制

Tricine-SDS-PAGE電泳緩沖液共有兩種,為電極緩沖液和凝膠緩沖液。電極緩沖液不同于常規(guī)SDS-PAGE電泳,其陽極緩沖液(即下牙槽緩沖液)僅由Tris鹽組成,pH值較高,為8.90。陰極緩沖液(即上牙槽緩沖液)除Tris鹽外,還有Tricine和SDS,pH值較低,為8.25。凝膠緩沖液包括分離膠和濃縮膠緩沖液,前者由3.0 M的Tris鹽和0.3% SDS組成,pH值為8.90;后者僅含Tris鹽,并用HCl將pH調(diào)至6.80。詳見表2。

表2 Tricine-SDS-PAGE電泳緩沖液的配制

1.2.3 分離膠、成層膠和濃縮膠的配制

根據(jù)所需膠濃度配制如下溶液,混勻后均勻灌入組裝好的電泳玻璃膠架中。利用水依次封閉各層膠面,當(dāng)膠與水出現(xiàn)清晰界限時(shí)表明聚合已經(jīng)完成。待膠聚合后用濾紙吸干水,繼續(xù)下一層膠的灌制。詳見表3。

表3 Tricine-SDS-PAGE電泳凝膠的配制

1.2.4 2×SDS上樣緩沖液的配制

按要求配制2×SDS上樣緩沖液,混勻后－20℃保存。詳見表4。

表4 2×SDS上樣緩沖液配制

1.3 蛋白上樣、電泳參數(shù)和染色

在蛋白樣品中加入2×SDS上樣緩沖液,100℃煮沸5 min,均勻混合樣品,使蛋白質(zhì)與SDS充分結(jié)合。準(zhǔn)備好電泳裝置,外槽加入陽極電泳緩沖液,內(nèi)槽加入陰極電泳緩沖液,利用上樣細(xì)槍頭將蛋白樣品加入凝膠的點(diǎn)樣孔中,恒壓80 V,開始電泳。待指示帶跑入分離膠時(shí),更換為120 V恒定電壓。電泳結(jié)束后取下電泳膠,利用快速考馬斯亮藍(lán)染色方法染色1 h。該染料只對(duì)蛋白質(zhì)染色,不需要脫色,可以直接肉眼觀察。待條帶清晰顯現(xiàn)后,掃描保存圖片。

2 結(jié)果

2.1 濃度為l6.8%和交聯(lián)度為5.8%分離膠的建立

分離膠是Tricine-SDS-PAGE電泳系統(tǒng)的主要載體,起著重要的分子篩作用,而分離膠的濃度在很大程度上直接決定著蛋白分離效果的優(yōu)劣。分離膠濃度是指100 mg凝膠溶液中含有單體(丙烯酰胺)和交聯(lián)劑(甲叉雙丙烯酰銨)的總克數(shù)。不同濃度的分離膠通過控制凝膠孔徑的大小,從而影響樣品的分離效果。提高分離膠濃度,其對(duì)小分子蛋白的分離效果也隨之提高。然而膠濃度并不是越高越好,當(dāng)分離膠濃度提高到25.0%時(shí),由于分離膠孔徑太小,電泳反而受阻。通過比較,本實(shí)驗(yàn)確定分離膠濃度為16.8%。

交聯(lián)度是指凝膠溶液中,交聯(lián)劑(甲叉雙丙烯酰銨)占單體(丙烯酰胺)和交聯(lián)劑總量的百分?jǐn)?shù)。合適的交聯(lián)劑和單體比例很重要。為了制作富有彈性、透明的凝膠,通過比較,本實(shí)驗(yàn)確定分離膠交聯(lián)度為5.8%。

2.2 SDS-PAGE電泳和Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果比較

常規(guī)SDS-PAGE電泳難以有效濃縮、分辨10 kD左右的蛋白條帶。在常規(guī)SDS-PAGE電泳圖中,10 kD分子量條帶無法得到有效濃縮,條帶彌散(圖1A箭頭處所示),且相應(yīng)蛋白條帶模糊不清楚(圖1A)。

Tricine-SDS-PAGE電泳采用Tricine代替甘氨酸作為尾隨離子,通過16.8%分離膠、10.1%成層膠和6.6%濃縮膠的組合,利用10.4%甘油降低聚丙烯酰胺凝膠孔徑,從而較好地濃縮了10 kD分子量條帶(圖1B、C箭頭處所示),有效清晰地分離出分子量為11.0 kD的S100A8(圖1B)和11.8 kD的S100A11(圖1C)等兩個(gè)針刺抗哮喘小分子蛋白。圖中M為分子量Marker。

圖1 SDS-PAGE電泳和Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果比較圖

3 討論

針灸效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究常借鑒蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)等高通量方法從整體層面上觀察和分析針灸效應(yīng)響應(yīng)基因、應(yīng)答蛋白及其相互作用機(jī)制[9]。隨著研究深入,發(fā)現(xiàn)越來越多的小分子蛋白在針刺抗哮喘效應(yīng)物質(zhì)研究和針刺預(yù)防1型糖尿病效應(yīng)物質(zhì)研究中起著至關(guān)重要的作用[8,10]。因此建立一種快速、有效的檢測(cè)小分子蛋白方法,已成為實(shí)驗(yàn)研究體系不可缺少的組成部分之一。

SDS-PAGE電泳分辨率除了受濃縮膠和分離膠的濃度、交聯(lián)度影響外,和緩沖液pH值,樣品制備方法等密切相關(guān)[11]。但要想獲得良好的小分子蛋白分辨率,首先就需要有效地對(duì)其進(jìn)行濃縮。Schagger等利用Tricine-SDS-PAGE電泳系統(tǒng)成功地解決了分子量為1-100 kD蛋白的濃縮和分離問題[6]。本研究同樣采用解離常數(shù)為8.15的Tricine代替解離常數(shù)較高的Glycine(甘氨酸,解離常數(shù)pK為9.6)作為尾隨離子,可以使蛋白樣品更好地被壓縮。因?yàn)樵跐饪s膠中Tricine和Glycine均可跟隨氯離子形成前后兩條離子帶,從而把上樣蛋白壓縮。Tricine解離常數(shù)小,和先導(dǎo)氯離子靠得更為接近,可以把蛋白壓縮在更為狹窄的區(qū)域,其結(jié)果是對(duì)小分子蛋白質(zhì)的濃縮更有效[12]。

Tricine-SDS-PAGE電泳系統(tǒng)較常規(guī)的SDS-PAGE系統(tǒng)相比,在濃縮膠和分離膠之間引入成層膠,其目的是使小分子蛋白質(zhì)和多肽的條帶更加尖銳,避免彌散和拖尾。此外,由于小分子蛋白對(duì)染料的結(jié)合能力較弱、易擴(kuò)散、著色較差,還需要使用快速蛋白染色。

本研究采用Tricine作為尾隨離子,構(gòu)建濃度為l6.8%的分離膠、10.1%的成層膠和6.6%的濃縮膠,利用10.4%甘油降低聚丙烯酰胺凝膠孔徑,優(yōu)化了Tricine-SDS-PAGE電泳系統(tǒng),清晰分離了S100A8, S100A11等針刺抗哮喘小分子蛋白,上樣量小,重復(fù)性好。這為深入開展針灸效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1] 楊永清,尹磊淼,徐玉東,等.系統(tǒng)生物學(xué)與針灸學(xué)[J].上海針灸雜志,2009,28(10):616-619.

[2] 楊永清,陳漢平,王宇,等.針灸效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究[J].上海針灸雜志,2006,25(2):4-6.

[3] 楊永清,王宇,劉艷艷,等.針灸效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究與針灸作用原理研究[J].上海針灸雜志,2008,27(9):39-41.

[4] 王宇,馬淑蘭,崔建美,等.針刺抗哮喘大鼠血清差異組份的色譜分析[J].上海針灸雜志,2006,25(8):41-43.

[5] 尹磊淼,徐玉東,王宇,等.針刺正常大鼠肺組織SAGE標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫的基因分類研究[J].上海針灸雜志,2010,29(5):315-317.

[6] Schagger H. Tricine-SDS-PAGE[J]. Nat Protoc, 2006,1(1):16-22.

[7] LaemmLi UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970,227(5259):680-685.

[8] Yin LM, Jiang GH, Wang Y,. Use of serial analysis of gene expression to reveal the specific regulation of gene expression profile in asthmatic rats treated by acupuncture[J]. J Biomed Sci, 2009,16 (1):46.

[9] 陳漢平.刺灸誘生特異蛋白猜想[J].上海針灸雜志,2006,25(10): 1-2.

[10] Yin LM, Li HY, Zhang QH,. Effects of S100A9 in a rat model of asthma and in isolated tracheal spirals[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010,398(3):547-552.

[11] Judd RC. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Peptides. In Walker JM (eds) The Protein Protocols Handbook[M]. 2nd edn, Humana Press Inc, Totowa, NJ. 2002, chapter 13:73-79.

[12] Schagger H, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacry- lamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa[J]. Anal Biochem, 1987,166(2):368-379.

Application of Optimized Tricine Electrophoresis Method in Detecting Low Molecular Weight Proteins of Acupuncture Effect

-1,2,1,2,-2,-1,-2.

1.,200030,; 2.,201203,

To improve a Tricine-SDS-PAGE electrophoresis technology suitable for isolation and identification of low molecular weight proteins of acupuncture effect.Tricine electrophoresis system was optimized by adjusting polyacrylamide concentration and the crosslinking degree in separation gel and adding an appropriate amount of glycerol.Compared with conventional Glycine-SDS-PAGE electrophoresis system, Tricine-SDS-PAGE electrophoresis system containing separation gel with l6.8% polyacrylamide and 5.8% crosslinking degree, and 10.4% glycerol significantly reduced 10 kD protein dispersion and successfully isolated two low molecular weight anti-asthma proteins of acupuncture effect: S100A8 with molecular weight of 11.0 kD and S100A11 with molecular weight of 11.8 kD.The optimized Tricine-SDS-PAGE electrophoresis system can effectively isolate low molecular weight proteins of acupuncture effect.

Acupuncture effect; Material foundation research; Tricine electrophoresis; Low molecular weight protein

1005-0957(2012)03-0191-03

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2012.03.191

2011-11-23

國(guó)家自然科學(xué)基金(81001548,30873299,81173341, 81173332);上海市教委和上海市教育發(fā)展基金會(huì)“晨光計(jì)劃”資助項(xiàng)目(10CG45);上海市衛(wèi)生局青年基金(2009Y096);上海高校優(yōu)秀青年教師科研基金(szy09022);上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(S30304)

尹磊淼(1983 - ),男,助理研究員,博士,博士后,E-mail: collegeylm@163.com

楊永清(1964 - ),男,研究員,博士,E-mail:dryqyang@163. com