李歐靜，張桂華，蘭青闊 ，王 永 ，趙 新 ，朱 珠 ，陳 銳，郭永澤

（1.天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，天津 300381；2.天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，天津 300192）

蔬菜種子純度是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，其鑒定方法有田間形態(tài)試驗、RAPD、SSR、同工酶標(biāo)記等，但這些方法在操作性、穩(wěn)定性、多態(tài)性等方面不能滿足目前的需要。單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是指基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。近年來，SNP標(biāo)記以其二態(tài)性、等位基因性、高密度性以及高遺傳穩(wěn)定性等優(yōu)點成為研究熱點，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物遺傳學(xué)研究[1]和品種鑒定當(dāng)中[2]。

焦磷酸測序技術(shù)（Pyrosequencing）是實時、定量分析DNA序列的新一代測序技術(shù)，是基于引物引導(dǎo)的多聚酶延伸下的核酸合成的新型DNA測序技術(shù)[3]，具有操作簡單、費用低、通量高、結(jié)果準(zhǔn)確和自動化程度高等優(yōu)點，特別適合SNP、small InDel等短序列分析，具有較高的靈敏性和準(zhǔn)確性。Pyrosequencing技術(shù)的另一突出優(yōu)勢在于與DNA池（DNA Pooling）技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用。Pooling技術(shù)的原理是將已知對照樣本和多個未知樣本混合在一起進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)基因分型、最后用統(tǒng)計學(xué)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到已知樣本在總樣本中的比例[4]。Pyrosequencing和Pooling聯(lián)用技術(shù)兼有Pyrosequencing的定量測序優(yōu)點和Pooling高通量的優(yōu)點，特別適用于大規(guī)模樣品的等位基因頻率分析[5]，能滿足種子純度鑒定大樣本量的需求。

筆者分析了黃瓜SNP位點CLA13（C/G）在16個黃瓜育種材料中的多態(tài)性，結(jié)合Pyrosequencing和DNA Pooling技術(shù)，建立3Pooling SNP Pyrosequencing標(biāo)準(zhǔn)曲線，快速、高效的鑒定黃瓜種子純度，旨在為后續(xù)的品種鑒定及大批量的蔬菜種子純度鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料：16個黃瓜雜交種及其母本、父本的基因組DNA由天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司黃瓜研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 SNP位點的選擇及引物設(shè)計 經(jīng)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索、驗證獲得黃瓜SNP位點CLA13（C/G），利用PSQ Assay Design軟件設(shè)計用于焦磷酸測序的PCR引物、測序引物以及需要分析的目標(biāo)序列（Sequence to Analyze），其中前引物5’加生物素（Biotin）標(biāo)記修飾見表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 CLA13（C/G）位點焦磷酸測序引物序列

1.2.2 焦磷酸測序反應(yīng) 包括用于制備測序反應(yīng)模板的PCR擴增和焦磷酸測序反應(yīng)[6]。PCR擴增采用50μL反應(yīng)體系，其中2×GoTaq Green Master Mix（Promega）25μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1μL，DNA模板100 ng，滅菌去離子水補足至50μL。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min；50個循環(huán)反應(yīng)（94℃30 s，50℃ 30 s，72℃ 40 s）；72℃延伸 7 min；4℃保存。PCR儀為ABIverity 96 well Thermal cycler。

焦磷酸測序反應(yīng)在PyroMark ID焦磷酸測序儀（Biotage）上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物中加入47μL Binding buffer（Biotage）和 3 μL Sepharose beads（Biotage），1 300 r/min渦旋混勻 15 min，經(jīng) Vacuum prep workstation單鏈分離，釋放到預(yù)先加入38.8μL Annealing buffer（Biotage）和1.2μL測序引物（10 μmol/L）的PSQ 96測序反應(yīng)板中，80℃金屬加熱塊（Labnet）上加熱2min后冷卻至室溫。將酶、底物和A、T、C、G 成分（Qiagen）加入試劑倉，即可上機測序。測序結(jié)果可通過分型分析模式（Genotyping）直接獲得樣品SNP類型，或者通過等位基因頻率AQ（Allele Quantification）模式分析C基因型頻率C%和G基因型頻率G%。

1.2.3 DNA Pooling最適數(shù)量的確定 取3號雜交種（基因型記為C/G）及其父本（基因型記為C/C）基因組DNA，精確稀釋至20 ng/μL，按照C/C與C/G 的比例為 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9 和1∶19 進(jìn)行混合，模擬 2、3、4、5、6、7、8、9、10、20 個雜交種Pooling中混雜1個C/C的情況。將上述10種充分混勻DNA模板進(jìn)行PCR擴增及焦磷酸測序分析，獲得C等位基因頻率C%和G等位基因頻率G%（G%=1-C%）。試驗設(shè)置10次重復(fù)。

1.2.4 3 Pooling SNPPyrosequencing標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取3號雜交種（C/G）及其母本（G/G）、父本（C/C）的基因組 DNA（20 ng/μL），按照 C3（3C/C）、C2（2C/C∶1C/G）、C1（1C/C∶2C/G）、Hybrid（3C/G）、G1（1G/G∶2C/G）、G2（2G/G∶1C/G）、G3（3G/G）的梯度比例混合DNA模板，進(jìn)行PCR擴增和焦磷酸測序，分析等位基因頻率C%，并建立C%與不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 3 Pooling SNPPyrosequencing分析模型樣品檢驗 選擇SNP位點為C/G分型的黃瓜雜交品種8號進(jìn)行樣品檢驗試驗。選顆粒飽滿、大小均勻籽粒30粒，浸泡、萌發(fā)、每3個種子DNA等量混合，進(jìn)行PCR擴增、焦磷酸測序以及等位基因頻率分析。根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線模型，換算出其中來自親本的污染。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 SNP多態(tài)信息量PIC值使用PIC_CALC軟件計算，TTEST和標(biāo)準(zhǔn)曲線制定使用office excel軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 CLA13（C/G）位點分型及多態(tài)信息量分析

對16個黃瓜雜交種及其親本的CLA13（C/G）位點進(jìn)行PCR擴增及焦磷酸測序分析，分型結(jié)果見表2。在16個子代中，7個檢測為C/G雜合，因此CLA13（C/G）位點適合7個品種做黃瓜種子純度鑒定試驗。進(jìn)一步對CLA13（C/G）位點多態(tài)信息量（PIC）分析表明，在16個黃瓜雜交種的群體中該SNP位點PIC達(dá)0.556，處于高度多態(tài)。

2.2 DNA Pooling最適數(shù)量的確定

為提高種子純度檢測效率，研究引入DNA Pooling技術(shù)，通過分析DNA Pooling中SNP位點的等位基因頻率，確定樣品的雜合程度，并轉(zhuǎn)換為種子純度。按一定梯度比例混合C/C基因型和C/G基因型DNA，模擬不同DNA Pooling，并通過比較不同DNA Pooling下等位基因頻率差異顯著性，確定最適DNA Pooling。

表2 16個黃瓜雜交種及其親本CLA13（C/G）位點分型分析

如表3所示，隨著Pooling數(shù)量的增加，C%平均值逐漸下降并接近50%。對2～20 Pooling C%值進(jìn)行TTest分析顯示，4 Pooling以下呈顯著差異水平，3 Pooling以下呈極顯著差異水平?？紤]試驗的準(zhǔn)確性和可靠性，選擇3 Pooling作為最佳Pooling數(shù)量，即在種子純度檢測過程中，將3粒種子作為1個Pooling進(jìn)行檢測具備較高的效率和準(zhǔn)確度。

2.3 3 Pooling SNPPyrosequencing標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

為了把C等位基因頻率轉(zhuǎn)換為3 Pooling中雜交種的數(shù)量，需建立3 Pooling SNPPyrosequencing標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，隨著C3-G3七個梯度樣品中C基因降低和G基因升高，焦磷酸測序峰圖（圖1A）中C堿基峰高從后續(xù)堿基T、C、G的1倍峰高逐步降低為0，G堿基峰高從0逐漸升高到與后續(xù)堿基T、C、G的峰高持平；建立C%與C3-G3七個梯度樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1B），兩者呈線性關(guān)系，R2達(dá)0.998 2。參考該標(biāo)準(zhǔn)曲線，可通過畫圖比較或計算的方法將C%轉(zhuǎn)換出3 Pooling樣品中是否含有或含有幾粒C/C或G/G類型種子。

表3 不同DNA Pooling數(shù)量C等位基因頻率分析

圖1 3Pooling下C梯度測序結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 3 Pooling SNPPyrosequencing分析模型樣品檢驗

如表4所示，10個Pooling中第1 Pooling C%值為65.3%，第7 PoolingC%值為66.2%，說明第1 Pooling和第7 Pooling的3粒種子中含有1個C/C類型的種子，而其他8個Pooling均為C/G類型的種子。因此，該30粒種子中含有2粒非雜交種，純度可記為93.3%。

表4 3Pooling檢驗黃瓜雜交品種種子純度結(jié)果

3 討論與結(jié)論

種子純度是指雜交種后代表型的一致性，是黃瓜種子質(zhì)量的重要指標(biāo)。造成黃瓜種子純度低的主要原因有親本純度不夠高、生物混雜和機械混雜等原因，其中來自母本的混雜較為普遍。因此，雜交種中母本基因型的檢測是分子檢測的重點。SNP分子標(biāo)記是繼SSR標(biāo)記以后的第三代分子標(biāo)記，具有高密度和高度遺傳穩(wěn)定性等優(yōu)點，而且大多數(shù)只有兩種等位基因型，所以也被稱為雙等位基因標(biāo)記（biallelic marker），能夠明顯區(qū)分出母本、父本及雜交種基因型。因此，SNP分子標(biāo)記適合于黃瓜品種真實性和純度檢測的要求。

研究將SNP標(biāo)記技術(shù)、Pyrosequencing技術(shù)和DNA Pooling技術(shù)有機結(jié)合，建立3 Pooling SNP Pyrosequencing種子純度檢測分析模型，克服了RAPD、SSR等分子標(biāo)記技術(shù)必須凝膠電泳的瓶頸，提高了黃瓜雜交種純度鑒定效率。同時，3 Pooling SNPPyrosequencing分析模型可應(yīng)用于其他作物種子純度鑒定，具有推廣價值和應(yīng)用前景。

[1] 李兆波，吳 禹，王 巖，等.SNP標(biāo)記技術(shù)及其在農(nóng)作物育種中的應(yīng)用[J].遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2010，5（12）：8-9.

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