楊 楊

（江蘇省句容市畜牧獸醫(yī)站，句容 212400）

雖然豬精液保存技術(shù)的研究已有近50年的歷史[1]，但其保存效果很不理想。主要原因是低溫保存和冷凍保存后精子活率、頂體完整率、受精能力等都比鮮精要差[2]。在精液低溫保存的過程中，精子膜的完整性對復(fù)蘇后精子的活力和受精能力是至關(guān)重要的。目前，國內(nèi)外已有報道，在牛、羊的凍精稀釋液中添加糖類、氨基酸和牛血清白蛋白能保護(hù)精子質(zhì)膜的穩(wěn)定性[3-6]。

甘油和糖類是常用的冷凍保護(hù)劑，一般甘油限制在1%～3%為宜[7]。在豬精液，冷凍稀釋液中多加有甘油等抗凍物質(zhì)，以增強(qiáng)精子抗凍能力，對防止冰晶發(fā)生有重要作用。但甘油濃度過高對精子有毒害作用，造成精子頂體和頸部損傷，尾部彎曲等。對豬精子來說，當(dāng)甘油濃度增大時，冷凍精液，活率雖高，但受胎率極不理想。由于多數(shù)糖類能被細(xì)胞分解代謝。因此，常使用糖類代替部分甘油，以減少對精子的毒害作用，這方面已有不少報道[1，12，15]，但僅利用雙糖（乳糖和蔗糖）代替甘油的研究還未見報道。

雙糖包括多種，如乳糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖、纖維二糖等。本實驗主要研究木糖醇的添加量。即豬精液冷凍稀釋液中單獨添加不同濃度的乳糖或蔗糖，以及添加不同比例的乳糖和蔗糖代替部分甘油對顆粒凍精凍后活率，活力，頂體完整率和精子畸形率的影響。

手握法采集成年長白種公豬精液，離心去精清，收集富含精子的部分，在精液稀釋液中加入不同濃度的木糖醇和甘油，采用液氮熏蒸法制作顆粒凍精。在40℃～45℃下解凍觀察。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

體質(zhì)健康、性欲旺盛的成年長白種公豬1頭，18月齡。

1.2 實驗設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、電動離心機(jī)、生物顯微鏡、恒溫載物臺、電子天平、冰箱、聚四氟乙烯板、超低溫溫度計、雙重水自動蒸發(fā)儀。

1.3 稀釋液的配制

電子天平準(zhǔn)確稱量各種試劑后，用雙蒸水定容、過濾、滅菌，配制成Ⅰ液。采精前，按比例配成Ⅱ液，置于35°C水浴中預(yù)熱。其各種物質(zhì)含量如下所示：

Ⅰ液：葡萄糖8 g；蒸餾水 100 ml。

Ⅱ液：?、褚?7 ml，加入卵黃20 ml，青霉素和鏈霉素各5～10萬U。

最后向Ⅱ液加入不同濃度的蔗糖、乳糖即為所用的冷凍稀釋液。其添加量詳見表1、表2。

表1 在稀釋液中單獨乳糖和蔗糖的含量（g/100 ml）

表2 在稀釋液中按不同比例添加乳糖與蔗糖（g/100 ml）

1.4 精液采集

采精前將集精杯預(yù)熱至35 ℃～37℃，以發(fā)情母豬誘導(dǎo)成年公豬爬跨。待公豬陰莖伸出后，用手握法采精。采精后選擇中段濃份精液用4層紗布過濾，除去膠狀物后，在37℃下進(jìn)行常規(guī)品質(zhì)檢查。選擇無異味、色澤為乳白色、精子形態(tài)正常、活率在0.7以上的精液用于實驗。

1.5 精液的預(yù)處理

將合格精液在保溫壺中（32℃～35℃）中靜置60～80min，使精子和精清充分接觸，然后經(jīng)800 r/min離心10 min，棄去上部精清的4/5。為防止長時間靜置使豬精子進(jìn)入假死狀態(tài)，離心前應(yīng)輕輕晃動集精瓶數(shù)次，以使精子恢復(fù)活力。

1.6 精液的稀釋與平衡

采用二次稀釋法，先將Ⅰ液按1∶1的比例緩慢倒入精液中進(jìn)行等溫稀釋（32℃～35 ℃）后，再用12～15層紗布包裹集精瓶，連同Ⅱ液一起放入2℃～5 ℃冰箱中平衡2 h，然后加入與第一次稀釋后精液總量相等的Ⅱ液，使精液最終稀釋比例為1：3，繼續(xù)平衡1～2 h備用。

1.7 低溫精液的制作

低溫保存的溫度是0℃～5℃。一般將稀釋好的精液置于冰箱或廣口保溫瓶中，在保存期間要保持溫度恒定，不可過高過低。操作時注意嚴(yán)格遵守逐步降溫的操作規(guī)程，原則上精液稀釋后，要逐漸降溫到0℃～5℃，避免精子發(fā)生冷休克。所以一般要用平均每30 min降低5℃的速度降溫，即下降速度約為0.2℃/min。在生產(chǎn)實踐中，為了提高工作效率，都采用直接降溫法。即將分裝有稀釋精液的試管（或小瓶），包以數(shù)層紗布或棉花，再裝入塑料袋中，而后直接放入冰箱（0℃～5℃）或裝有冰塊的廣口保溫瓶中，也可將其放入30℃溫水（室溫）杯中，再一起直接放入0℃～5℃的環(huán)境中，經(jīng)1～2 h。精液溫度降至0℃～5℃。

1.8 解凍與鏡檢

顆粒凍精采用干解凍法，將顆粒凍精放入滅菌試管內(nèi)，用40℃～45℃溫水解凍（時間為8～10s），在37℃恒溫載物臺上，400～600倍生物顯微鏡下評定活率，頂體完整率，精子畸形率等指標(biāo)。

1.9 數(shù)據(jù)處理

按統(tǒng)計學(xué)方法處理各組數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加木糖醇和甘油對豬精液在室溫下活率的影響

選取不同比例的乳糖或蔗糖，加入稀釋液中制成顆粒凍精，結(jié)果如圖1所示。

圖1 稀釋液中單獨添加乳糖或蔗糖時的活率

由圖1可知，1號、5號的活率最好，顯著高于其他組（P<0.05）。即在稀釋液中添加1%的乳糖效果最好（P<0.05），在添加蔗糖時以2%的比例最佳（P<0.05），而添加1%的乳糖又較添加2%的蔗糖好（P<0.05）。從總體來看，添加乳糖比添加蔗糖的效果好。

2.2 單獨添加木糖醇對豬精液室溫下活率的影響

在稀釋液中按比例單獨添加乳糖或蔗糖，以替代不同濃度的甘油。結(jié)果詳見表3。

從表3可以看出，精子畸形率檢測中1號、2號明顯優(yōu)于其他（P＜0.05）。4號及6號頂體完整率與對照組比較差異顯著（P＜0.05）。

2.3 添加木糖醇和甘油對豬精液5度下活率的影響

選取5種不同比例的乳糖與蔗糖的稀釋液（乳糖：蔗糖），替代部分甘油，制成顆粒凍精解凍后的精子活率結(jié)果如圖2所示。

圖2 同時添加乳糖和蔗糖時精子的活率

由圖2可知，B組、C組的活率較好，分別達(dá)到0.39，0.35且與其他組差異顯著（P<0.05）。

2.4 不添加甘油對豬精液5度下活率的影響

選取5種不同比例的乳糖與蔗糖的稀釋液（乳糖：蔗糖），替代部分甘油，結(jié)果詳見表4。

從表4可以看出，精子畸形率A、B組差異顯著（P<0.05）。而B、C組的頂體完整率較好，且差異顯著（P<0.05）。

3 討論

3.1 單獨添加乳糖或蔗糖對豬精液凍后活率的影響

關(guān)于豬凍精稀釋液成分多種多樣，但使用最多的還是糖類。目前，國內(nèi)外已有報道，糖類、氨基酸和牛血清白蛋白通過對質(zhì)膜的穩(wěn)定，發(fā)揮其對精子的保護(hù)作用[3-6]。牧人等[1]研究了蔗糖等對白絨山羊冷凍精液的影響，褚仁忠等[8]也研究了糖類保護(hù)劑對山羊凍精的影響，結(jié)果都表明在羊上糖類對冷凍精液有較好的保護(hù)作用。在豬上也有較多的關(guān)于糖類稀釋液的研究，李青旺等[9]對添加不同量的葡萄糖，蔗糖，乳糖的稀釋液作了詳盡的研究，結(jié)果表明低濃度的乳糖與葡萄糖混合使用可取得較好的效果，豬精液凍后活率可達(dá)0.53。而且李震鐘等[10]研究也表明，在豬凍精稀釋液中添加2%～4%的葡萄糖效果較好，濃度過高對精子頂體就會有損害。本實驗表明，稀釋液中添加1%乳糖時，精子活率較高（P<0.05），說明乳糖可以代替部分的甘油，以1%為宜。稀釋液中添加2%蔗糖時，精子活率比對照組的活率高（P<0.05），說明蔗糖也可代替部分的甘油，以2%為宜。從添加乳糖和添加蔗糖對照來看，添加乳糖的顆粒凍精活率較添加蔗糖的活率高。說明乳糖比蔗糖更適宜代替部分甘油。這與Paulenz等[11]研究結(jié)論相似。

3.2 單獨添加乳糖或蔗糖對豬精液凍后精子畸形率，頂體完整率的影響

本實驗表明，2號、3號顆粒凍精的精子畸形率明顯較低。說明一定量的乳糖（1%～2%）對精子具有保護(hù)作用。減少了由甘油引起的精子頂體和頸部的損傷及尾部彎曲等。而5、7號頂體完整率較好，說明添加一定量的蔗糖可以減少精子頂體的損傷，對精子具有一定的保護(hù)作用。

3.3 同時添加乳糖和蔗糖對豬精液凍后活率的影響

本實驗表明，當(dāng)稀釋液中乳糖與蔗糖比例為2∶1時，顆粒凍精的活率最好，為0.39，差異顯著（P<0.05）。當(dāng)乳糖與蔗糖比例為1∶2時，顆粒凍精的活率為0.35，差異顯著（P<0.05）。當(dāng)這2者進(jìn)行比較，比例為2∶1時的活率明顯優(yōu)于1∶2（P<0.05）。從總體來看，混合添加乳糖與蔗糖的效果優(yōu)于單獨添加的效果。

表3 稀釋液中單獨添加乳糖或蔗糖的結(jié)果（%）

表4 同時添加乳糖和蔗糖對豬精液凍后精子畸形率及頂體完整率的影響（%）

3.4 同時添加乳糖和蔗糖對豬精液凍后精子畸形率及頂體完整率的影響

實驗表明，當(dāng)稀釋液中乳糖與蔗糖比例為2∶1或1∶2時，頂體完整率明顯上升，并且差異顯著（P<0.05），說明當(dāng)稀釋液中乳糖與蔗糖比例為2∶1或1∶2時對精子頂體有一定的保護(hù)作用?？梢钥闯?，2種雙糖對精子都有一定的保護(hù)作用，但乳糖較蔗糖要好一些，所以當(dāng)乳糖比例較高時，精子活率，頂體完整率都較好一些。

目前，各種家畜冷凍精液的稀釋液一般都含有糖類和甘油，但并沒有一個明確的最佳添加量。尤其是甘油，已證實，冷凍稀釋液中添加棉籽糖、蔗糖、等類物質(zhì)，以及甘油、乙二醇、緩沖劑、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）及可可堿和萘類物質(zhì)對公豬精液的冷凍保存均有幫助但在所篩選的各種動物精子冷凍保護(hù)液毫無例外的都保留有甘油，研究表明，甘油的冷凍保護(hù)效果在高濃度時效果最明顯，然而當(dāng)甘油濃度高于0.5 ml/L（≈9.2%）時對精子是有害的[12-14]。本實驗研究中甘油添加量并沒有一個確定的量，在添加乳糖時，甘油的添加量為2%時效果最好，這與周佳勃等[15]，李青旺等[9]的研究結(jié)果相似。但在添加蔗糖中甘油的添加量為1%時效果較其他的要好，綜合來看這應(yīng)與糖的種類和添加量有關(guān)。這還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

4.1 稀釋液中添加1%和2%乳糖時，精子畸形率較低，分別為7.1%和8.6%（P<0.05）。添加1%及3%蔗糖時頂體完整率較好，分別為86.7%和86.8%（P<0.05）。

4.2 稀釋液中添加1%乳糖時，活率為0.38差異顯著（P<0.05）。稀釋液中添加2%蔗糖時，活率為0.36差異顯著（P<0.05）。

4.3 當(dāng)稀釋液中乳糖與蔗糖比例為2∶1或1∶2時，頂體完整率為88.2%及88%差異顯著（P<0.05）。

4.4 稀釋液中乳糖與蔗糖以2：1及1：2的比例添加時，活率最好，分別為0.39和0.36差異顯著（P<0.05）。

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