武俊瑞，李 欣，張 苗，李曉忱，楊臣辰，岳喜慶

自然發(fā)酵酸菜汁中乳桿菌的分離鑒定

武俊瑞，李 欣，張 苗，李曉忱，楊臣辰，岳喜慶*

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866)

通過選擇性培養(yǎng)和形態(tài)學觀察，從分別采自遼寧省阜新、葫蘆島、興城、營口、錦州的5份傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜汁中，分離純化和篩選出4株具有耐酸特性的乳桿菌疑似菌株(HLD1-3、YK1-2、JZ6-3、XC4-4)，并對其進行運動性、過氧化氫酶、石蕊牛乳、明膠液化、不同溫度生長、不同NaCl質(zhì)量濃度生長、糖發(fā)酵實驗等傳統(tǒng)生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，進一步鑒定其屬種。二者結(jié)果均表明:4株耐酸乳酸菌均屬于乳桿菌屬，其中，HLD1-3和YK1-2屬于乳桿菌屬的清酒乳桿菌種，而JZ6-3和XC4-4屬于乳桿菌屬的植物乳桿菌種。由此可以推斷，東北自然發(fā)酵酸菜可作為潛在益生乳酸菌分離篩選的資源庫。

酸菜；耐酸；乳桿菌；分離鑒定

酸菜是將新鮮蔬菜經(jīng)乳酸菌發(fā)酵等一系列的加工方法賦予其一定酸味口感和香氣的發(fā)酵制品，有著悠久的制作和食用歷史。自然發(fā)酵酸菜以酸鮮純正、脆嫩芳香、清爽可口、解膩開胃、增進食欲等特點和功效深受人們的喜好，在我國，東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜聞名遐邇[1-2]。其中蘊藏著豐富的乳酸菌資源，近年來受到了食品行業(yè)的廣泛關(guān)注[1-4]。

本實驗擬通過選擇性培養(yǎng)和形態(tài)學觀察，從采自遼寧省阜新、葫蘆島、興城、營口、錦州等地的5份傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜汁中，分離純化和篩選出4株具有耐酸特性的乳桿菌疑似菌株，并對其進行生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，進一步鑒定其屬種，為進一步進行深入研究和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采自阜新、葫蘆島、興城、營口和錦州農(nóng)家自制傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜汁樣品各1份，共5份。

培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基、PY培養(yǎng)基、PYG培養(yǎng)基、明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

細菌基因組DNA小量制備試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、DNA Marker 上海桑尼生物科技有限公司；革蘭氏染色液、過氧化氫、葡萄糖、瓊脂、石蕊、明膠等。

1.2 儀器與設(shè)備

2720型Thermal cycler PCR儀、3730-XL型測序儀美國ABI公司；5804R型離心機 德國Eppendorf公司；Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng) 中國天能公司；ZMB-300E顯微鏡 上海宙山精密光學儀器有限公司；TGL-16C離心機 上海安亭科學儀器廠；電熱手提式高壓殺菌鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 采樣

在遼寧省阜新、葫蘆島、興城、營口、錦州等地的農(nóng)家，采集采用傳統(tǒng)方法發(fā)酵的酸菜汁250mL，同時測定樣品pH值和溫度，并記錄發(fā)酵過程及時間等信息，置于冰盒中運回實驗室，于－60℃超低溫冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品的分離純化

采用傾注培養(yǎng)法，對樣品中的乳酸菌進行分離純化。吸取1mL酸菜汁樣品，接種于20mL添加了CaCO3的滅菌MRS固體培養(yǎng)基中，滅菌后MRS固體培養(yǎng)基在接種前要提前降溫至55℃并保持恒定，待瓊脂冷卻凝固后，放入?yún)捬醢l(fā)生器中，于30℃培養(yǎng)24～48h。挑取有Ca圈并且直徑在1～2mm的單菌落，在滅菌后MRS固體培養(yǎng)基上劃線分離，于30℃培養(yǎng)24～48h，如此反復(fù)劃線分離2～3次，直到確定為單菌落后編號，分別于10倍放大鏡下進行菌落形態(tài)學觀察，再挑取單個菌落，進行革蘭氏染色，于100倍光學顯微鏡下進行菌體形態(tài)學觀察，并記錄。

1.3.3 耐酸菌株的初步篩選[5-6]

分別將分離純化的12株待測菌株接種于pH值為3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，觀察菌株生長情況，能夠生長的初步判定為耐酸菌株。

1.3.4 生理生化鑒定[7-9]

1.3.4.1 過氧化氫酶實驗

用接種環(huán)挑取單個菌落，涂抹于已滴有15g/100mL H2O2的干凈載玻片上，觀察有無氣泡產(chǎn)生，如無氣泡產(chǎn)生即為H2O2酶陰性反應(yīng)。

1.3.4.2 葡萄糖產(chǎn)氣實驗

將耐酸菌株分別用接種于裝有倒置杜氏小管的PYG液體培養(yǎng)基中，于37℃的恒溫條件下培養(yǎng)24～48h，每天用肉眼觀察杜氏小管中有無氣泡產(chǎn)生，如果有氣泡產(chǎn)生則判定菌株為異型發(fā)酵陽性反應(yīng)。

1.3.4.3 運動性實驗

將耐酸菌株分別用接種針穿刺接種于MRS半固體培養(yǎng)基中，以不接種試管作空白對照，于37℃培養(yǎng)24～48h，觀察菌落分布狀況，如果只是沿穿刺線生長，而不向外擴散，則判定該菌株無運動性，反之則判定為有運動性。

1.3.4.4 石蕊牛乳實驗

向脫脂牛奶中加入40mL質(zhì)量濃度為25g/L的石蕊，混合均勻后分裝試管，115℃高壓蒸汽滅菌7min。最后在37℃培養(yǎng)24～48h，觀察石蕊牛乳的凝固反應(yīng)。

1.3.4.5 明膠液化實驗

將供試菌株接種于滅菌的明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以不接種試管作空白對照，于37℃培養(yǎng)24～48h，在低溫條件下觀察結(jié)果。當對照管凝固、接種管液化時，為陽性。

1.3.4.6 不同溫度生長實驗

將供試菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，以不接種試管作空白對照，分別置于15℃和45℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4d，觀察菌株生長情況。

1.3.4.7 不同NaCl質(zhì)量濃度生長實驗

將供試菌株接種于滅菌的且分別含有4、6.5、15g/100mL的NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，以不接種試管作空白對照，于37℃培養(yǎng)24～48h，觀察菌株生長情況。

1.3.4.8 糖發(fā)酵實驗

將供試菌株分別接種于含葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露醇、半乳糖和海藻糖的PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別以不接種的作空白對照，于37℃培養(yǎng)24～48h，觀察各試管顏色是否變黃。

1.3.4.9 利用16S rDNA序列分析進行鑒定[10-13]

總DNA的提取及純度的檢測:采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA。使用ND-1000型微量紫外分光光度計檢測基因組DNA的濃度以及OD260nm/OD280nm比值，再用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

16S rDNA 序列的PCR擴增:16S rDNA擴增引物:采用細菌通用引物，正向引物為27f(對應(yīng)于Escherichia coli 8～27位堿基):5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物為1495r(對應(yīng)于Escherichia coli 1495～1515位堿基):5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。

PCR擴增反應(yīng)體系(25μL):上下游引物各1μL (10pmol/μL)，模板DNA (100ng/μL) 1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP MIX 2μL，超純水17.2μL，rTaq酶0.3μL。

PCR擴增反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)30次；72℃延伸10min，4℃保溫。

檢測16S rDNA 擴增片段:擴增反應(yīng)完畢后，利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

16S rDNA 序列測定和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹:供試菌株P(guān)CR擴增產(chǎn)物測序由上海桑尼生物技術(shù)有限公司完成。得到的序列運用Clust X軟件校準 排齊后，在GenBank/ EMBL/DDBJ 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)同源性比對分析。以16S rDNA的序列同源性大于99%為標準進行屬種歸類。然后再對待測菌株與模式菌株16S rDNA序列利用程序MEGA 5.0中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進一步進行種屬鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品采集

表1 樣品采集情況Table 1 Information about pickle samples collected from 5 different regions

由表1可知，采集的5份樣品采集時的地點、溫度、pH值和發(fā)酵時間各不相同，樣品溫度在1.5～14.5℃之間，差異較大。樣品pH值在3.8～5.8之間，屬于偏酸性，發(fā)酵時間在70～120d之間，腌制的時間也不完全相同。

2.2 乳酸菌的分離及耐酸菌株初步篩選

通過選擇性培養(yǎng)和菌落及菌體形態(tài)學觀察，從5份自然發(fā)酵的酸菜汁中共分離得到12株革蘭氏染色陽性的乳酸菌疑似菌株。進一步通過觀察12株乳酸菌疑似菌株在pH值為3.0的MRS培養(yǎng)基中的生長情況，初步判定其是否耐酸，結(jié)果如表2所示。

表2 各菌株在pH值為3.0條件下的生長情況Table 2 Growth of 12 suspected Lactobacillus strains at pH 3.0

表3 供試菌株部分生理生化實驗結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of 4 screened strains

由表2可知，在pH值為3.0的MRS培養(yǎng)基中，只有菌株HLD1-3、XC4-4、YK1-2和JZ6-3能夠生長，其余菌株均不能生長，因此可以初步推斷出HLD1-3、XC4-4、YK1-2和JZ6-3等4株菌對酸性環(huán)境具有較強的耐受性。

2.3 生理生化實驗結(jié)果

對HLD1-3、XC4-4、YK1-2和JZ6-3這4株具有耐酸特性菌株，分別進行過氧化氫酶實驗、石蕊牛乳實驗、明膠液化實驗、運動性實驗、不同溫度生長實驗、不同NaCl質(zhì)量質(zhì)量濃度生長實驗和糖發(fā)酵實驗等生理生化鑒定，結(jié)果如見3、4。由表3可知，4株菌均表現(xiàn)為過氧化氫酶陰性，可初步判斷為乳酸菌，且葡萄糖產(chǎn)氣陰性，可排除異型發(fā)酵乳酸菌，其他特性分別為:運動性實驗陰性、明膠液化實驗陰性、石蕊牛乳實驗陽性、在45℃生長良好、15℃條件下不能生長、在含15g/100mL NaCl的MRS培養(yǎng)基中無法生長、在NaCl質(zhì)量濃度為4g/100mL時能正常生長，其中XC4-4和JZ6-3兩株菌株在NaCl質(zhì)量濃度為6.5g/100mL時仍然能夠生長。

表4 糖發(fā)酵實驗結(jié)果Table 4 Results of carbohydrate fermentation tests for 4 screened strains

由表4可知，XC4-4和JZ6-3均能利用選用的所有碳源；而HLD1-3和YK1-2則均不能利用甘露醇。

綜合以上生理生化實驗結(jié)果，根據(jù)《Bergey,s Manual of Systematic Bacteriology》[8]、《乳酸菌——生物學基礎(chǔ)及試驗方法》[9]，4株菌均為乳桿菌，其中，XC4-4和JZ6-3符合文獻中描述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的特征，而HLD1-3和YK1-2則符合文獻中描述清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)。

2.4 利用16S rDNA序列分析進行鑒定

用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測16S rDNA擴增產(chǎn)物，溴乙錠染色觀察發(fā)現(xiàn)在1500bp處有熒光條帶。經(jīng)過序列測定，4株乳桿菌XC4-4、JZ6-3、HLD1-3和YK1-2的16S rDNA基因序列，長度分別為1447、1443、1450bp和1444bp。

利用BLAST軟件，將菌株的16S rDNA序列與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中已知的16S rDNA基因序列進行比對，菌株XC4-4和JZ6-3的16S rDNA序列與植物乳桿菌的16S rRNA/rDNA序列相似性為100%，菌株HLD1-3和YK1-2與清酒乳桿菌的同源性為100%。利用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示。菌株XC4-4和JZ6-3與植物乳桿菌的系統(tǒng)位置最接近，菌株HLD1-3和YK1-2則與清酒乳桿菌的系統(tǒng)位置最近，與干酪乳桿菌、短乳桿菌、開菲爾乳桿菌等在同一分支，同屬于高溫型乳酸菌，與嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌形成的同源簇有明顯差異。綜上，4株耐酸菌株均屬于乳桿菌屬，其中JZ6-3和XC4-4鑒定為乳桿菌屬的植物乳桿菌種，HLD1-3和YK1-2則為乳桿菌屬的清酒乳桿菌種。

圖1 利用16S rDNA序列進行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence

3 結(jié) 論

近年來，一些針對酸菜中乳酸菌的研究也日趨成熟。張魯冀[1]、張楊[13]等從自然發(fā)酵酸菜汁中分離出10株乳桿菌，分別鑒定為短乳桿菌4株、植物乳桿菌3株、棒狀乳桿菌1株、干酪乳桿菌1株和米酒乳桿菌1株。部分學者[2,13-16]則從自然發(fā)酵的酸菜汁中分離出3株高產(chǎn)酸菌株，分別鑒定為腸膜明串珠菌、短乳桿菌和植物乳酸桿菌，結(jié)果顯示，植物乳桿菌可能是發(fā)酵酸菜的優(yōu)勢菌種，而從發(fā)酵酸菜汁中分離純化清酒乳桿菌目前國內(nèi)還未見報道。本研究從遼寧5個地區(qū)采集的5份傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜汁中分離純化出12株乳酸菌疑似菌株，篩選出YK1-2、HLD1-3、XC4-4和JZ6-3共4株耐酸菌株，通過生理生化實驗及16S rDNA序列分析，確定4株耐酸菌株均屬于乳桿菌屬，其中，HLD1-3和YK1-2屬于乳桿菌屬的清酒乳桿菌，而JZ6-3和XC4-4屬于乳桿菌屬的植物乳桿菌，可作為潛在益生菌株作進一步系統(tǒng)研究。該研究將為東北自然發(fā)酵酸菜中益生乳酸菌的分離篩選和進一步開發(fā)利用提供參考。

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Isolation and Identification of Lactobacillus Strains from Naturally Fermented Pickle Juice

WU Jun-rui，LI Xin，ZHANG Miao，LI Xiao-chen，YANG Chen-chen，YUE Xi-qing*
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Four acid-tolerant suspected Lactobacillus strains (HLD1-3, YK1-2, JZ6-3 and XC4-4) were isolated from five traditional pickle juices respectively collected from five regions of Liaoning province by selective cultivation and morphological observation. The four strains were identified based on physicochemical properties such as motility, catalase activity, litmus milk test, gelatin liquefaction test, growth under varying conditions of temperature NaCl concentration and carbohydrate fermentation tests and 16 S rDNA sequence analysis. The results indicated that all the strains belonged to the Lactobacillus genus. HLD1-3 and YK1-2 strains were identified as Lactobacillus sakei, while JZ6-3 and XC4-4 were identified as Lactobacillus plantarum. From these results, it can be speculated that naturally fermented pickle from Northeast China is a potential source of probiotic lactic acid bacteria.

pickle；acid tolerance；Lactobacillus；isolation

TS201.3

A

1002-6630(2012)15-0191-04

2011-07-01

國家自然科學基金項目(31000805)；國家“863”計劃項目(2011AA100902)；遼寧省教育廳科學技術(shù)研究項目(L2012249)

武俊瑞(1977—)，男，講師，博士，研究方向為動物性食品加工。E-mail:junruiwu@126.com

*通信作者:岳喜慶(1966—)，男，教授，博士，研究方向為動物性食品加工。E-mail:yxqsyau@126.com