曹燕妮，岳田利*，袁亞紅，高振鵬

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

輔酶Q10高產(chǎn)菌株的誘變選育

曹燕妮，岳田利*，袁亞紅，高振鵬

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

以豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum 1.1723)為出發(fā)菌株，利用紫外-LiCl和超聲波進(jìn)行誘變，以期獲得高產(chǎn)輔酶Q10菌株。結(jié)果表明：1g/L LiCl誘變能顯著提高菌株的正突變率，超聲波誘變會(huì)引起細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與構(gòu)成發(fā)生改變。通過(guò)羅紅霉素初篩和搖床復(fù)篩，獲得輔酶Q10突變株C40-05，胞內(nèi)輔酶Q10產(chǎn)量為1.198mg/g干菌，比出發(fā)菌株(0.389mg/g)提高了208%。菌株經(jīng)5次傳代培養(yǎng)，胞內(nèi)輔酶Q10產(chǎn)量下降了2.67%，突變株遺傳形狀穩(wěn)定，可作為輔酶Q10生產(chǎn)菌株。

豌豆根瘤菌；輔酶Q10；紫外-LiCl；超聲波；誘變

輔酶Q10(coenzyme Q10)又稱癸烯醌、泛醌，是脂溶性醌類化合物，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞等生物體內(nèi)，是電子傳遞的重要組成部分，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力和清除自由基的作用[1]。作為一種重要的生化藥劑，輔酶Q10在臨床醫(yī)學(xué)中有廣泛的應(yīng)用，對(duì)穩(wěn)定性心絞痛、肌肉疾病、帕金森癥等疾病有很好的療效[2-4]。研究表明，輔酶Q10的基本保健用量為每日20～30mg，長(zhǎng)期高劑量服用輔酶Q10可顯著改善人體的身體健康狀況[5]，對(duì)一些疾病有緩解和治療作用，因此輔酶Q10又被稱作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)增劑[6]。

輔酶Q10生產(chǎn)方法有動(dòng)植物組織提取法、植物細(xì)胞培養(yǎng)法[7]、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，其中微生物發(fā)酵法成本低、不受原料限制、易大規(guī)模生產(chǎn)、易分離純化、產(chǎn)品活性好[8]，因而成為最有發(fā)展前景的生產(chǎn)方法。目前，國(guó)內(nèi)制約微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q10的關(guān)鍵在于缺乏優(yōu)良的輔酶Q10生產(chǎn)菌株。

近年來(lái)，紫外與氯化鋰(LiCl)復(fù)合誘變被應(yīng)用于刺糖菌素[9]、1,3-丙二醇[10]、L-組氨酸[11]等高產(chǎn)菌株的選育中，多數(shù)都以LiCl作為篩選平板與紫外進(jìn)行復(fù)合誘變。超聲波誘變?cè)谌殒溇腫12]、L(+)-乳酸[13]、透明質(zhì)酸[14]等的高產(chǎn)菌株選育中也有較好的突破。本實(shí)驗(yàn)選擇豌豆根瘤菌為出發(fā)菌株，該菌株生物量高、發(fā)酵周期短，適合短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大量的突變株篩選，再對(duì)菌株進(jìn)行紫外-LiCl復(fù)合誘變和超聲波誘變處理，結(jié)合羅紅霉素抗性篩選，以期獲得輔酶Q10的高產(chǎn)突變株，旨為輔酶Q10的開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum 1.1723)，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心。

石油醚、無(wú)水乙醇、焦性沒(méi)食子酸均為分析純 西安化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

UV6200紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；MCFD5505真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)SIM公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、胰蛋白胨5、酵母提取物3、CaCl20.6，pH7.0。

初篩培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入羅紅霉素0.09mg/L。

1.3.2 生長(zhǎng)曲線的繪制

將活化好的豌豆根瘤菌種子液按2%的接種量接入50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于28℃、180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，每2h取1次樣，4500r/min離心10min，以每次所得的上清液校正分光光度計(jì)的零點(diǎn)，測(cè)波長(zhǎng)620nm處菌體光密度(OD)值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD620nm值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.3 紫外- LiCl誘變

1.3.3.1 菌懸液制備與LiCl誘變處理

分別取10mL培養(yǎng)8h的發(fā)酵液于4個(gè)無(wú)菌離心管中，4500r/min離心10min，棄上清液，收集菌體，沉淀用10mL生理鹽水洗滌離心2次。菌懸液的不同處理方式見表1，其中A組為對(duì)照組。

表1 菌懸液的LiCl誘變的不同處理方式Table 1 Different treatment styles for bacterial suspension

1.3.3.2 紫外誘變處理

開啟紫外燈預(yù)熱15min，取表1 中4組菌懸液各0.1mL注入基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板中，涂布均勻，準(zhǔn)備照射。照射需在紅光暗室中進(jìn)行，照射時(shí)間為4、8、12、16、20、24s，以未經(jīng)照射的平板作為對(duì)照，每組3個(gè)平行，照射后立即取出，用錫箔紙包好，28℃培養(yǎng)24h。根據(jù)所得致死率曲線，對(duì)菌株采用致死率為70%～80%的處理時(shí)間進(jìn)行誘變[15]。

將上述處理好的菌懸液做適當(dāng)稀釋，調(diào)整細(xì)胞濃度為107～108個(gè)/mL。

1.3.3.3 初篩

根據(jù)致死率曲線，確定照射時(shí)間，吸取0.1mL菌懸液涂布于羅紅霉素篩選平板上，進(jìn)行紫外照射。

1.3.3.4 復(fù)篩

經(jīng)初篩挑選的突變株，在豌豆根瘤菌種子液中培養(yǎng)16h，按2%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵液中，于28℃、180r/min搖床培養(yǎng)24h，離心收集菌體，使用醇?jí)A皂化法[16]測(cè)定胞內(nèi)輔酶Q10含量。

1.3.4 超聲波誘變

1.3.4.1 菌懸液制備

分別取10mL培養(yǎng)8h的發(fā)酵液于5個(gè)無(wú)菌離心管中，4500r/min離心10min，棄上清液，收集菌體，沉淀用10mL生理鹽水洗滌離心2次。

1.3.4.2 超聲波處理

超聲波工作條件為45kHz、280W、220V，對(duì)菌懸液依次誘變10、20、30、40、50min，取誘變后的菌懸液0.1mL涂布于完全培養(yǎng)基平板上，每組3個(gè)平行，28℃培養(yǎng)24h。

1.3.4.3 初篩

取超聲波處理20、30、40min的菌懸液各0.1mL，涂布于羅紅霉素篩選平板上，28℃培養(yǎng)24h后，挑選長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.4.4 復(fù)篩

經(jīng)初篩挑選的突變株，在種子液中培養(yǎng)16h，按2%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵液中，于28℃、180r/min搖床培養(yǎng)24h后，離心收集菌體，使用醇?jí)A皂化法測(cè)定胞內(nèi)輔酶Q10含量。

1.3.4.5 突變株基本生物學(xué)特性研究

對(duì)超聲波誘變處理獲得的突變株進(jìn)行革蘭氏染色處理和掃描電鏡觀察。

1.3.4.6 遺傳穩(wěn)定性

復(fù)篩出的突變株利用斜面接種作傳代實(shí)驗(yàn)，傳代5次后，考察輔酶Q10產(chǎn)量的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆根瘤菌的生長(zhǎng)曲線

由圖1可知，菌株在培養(yǎng)2h時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)16h時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期。本實(shí)驗(yàn)選取培養(yǎng)8h的發(fā)酵液制備菌懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為107～108個(gè)/mL。

圖1 豌豆根瘤菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Rhizobium leguminosarum

2.2 紫外-LiCl復(fù)合誘變

2.2.1 LiCl誘變的不同處理方式對(duì)菌體的影響

紫外-LiCl復(fù)合誘變中，經(jīng)過(guò)LiCl處理后的細(xì)胞進(jìn)行UV處理可能會(huì)導(dǎo)致AT-GC堿基對(duì)的轉(zhuǎn)換或者導(dǎo)致堿基的缺失，所以會(huì)增強(qiáng)正向突變的幾率[10]，但因?yàn)長(zhǎng)iCl本身對(duì)菌體有毒害作用，高質(zhì)量濃度的LiCl會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，因此需研究1g/L LiCl對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見表2。菌體經(jīng)4種不同方式處理后培養(yǎng)24h，加入LiCl的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，菌落總數(shù)基本一致，菌落大小相近，形態(tài)正常，實(shí)驗(yàn)組用LiCl處理細(xì)胞對(duì)菌體生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響，因此可以采用1g/L LiCl溶液來(lái)配制豌豆根瘤菌懸浮菌體。

表2 LiCl誘變的不同處理?xiàng)l件下菌體的生長(zhǎng)狀況Table 2 Effect of LiCl treatment conditions on the growth of Rhizobium leguminosarum

2.2.2 紫外-LiCl誘變的不同處理?xiàng)l件下的豌豆根瘤菌致死率曲線

圖2 紫外-LiCl誘變的不同處理?xiàng)l件下的豌豆根瘤菌致死率曲線Fig.2 Lethality curve of Rhizobium leguminosarum under different LiCl treatment conditions

由圖2可知，紫外照射相同時(shí)間下A組和B組之間致死率的變化比較小，但C組和D組的致死率較A組、B組有大幅度提高，表明LiCl在復(fù)合誘變中可增加菌體的輻射吸收量，隨著LiCl含量的增加，菌體輻射吸收量隨之增加，最后導(dǎo)致致死率升高。C組、D組懸浮菌體的溶液中LiCl的含量相同，但D組相同照射時(shí)間的致死率明顯高于C組，分析D組在對(duì)菌體處理的12h中處于勻速振蕩環(huán)境，菌體能比較均勻的懸浮于溶液中，充分與溶液接觸，從而使?jié)B入細(xì)胞中LiCl含量高于C組，在輻照處理時(shí)，增加的輻射量可直接作用于菌體內(nèi)部，引發(fā)菌體變異，導(dǎo)致菌體死亡，從而使得菌體的致死率有了一定的提高。

為了研究1g/L LiCl在紫外誘-LiCl復(fù)合變中對(duì)正突變率的影響，應(yīng)選擇兩者致死率相近的輻照時(shí)間作為誘變處理時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因此選擇A組照射12s和D組照射8s作為誘變條件。

2.2.3 紫外- LiCl誘變正突變率的比較

取稀釋好的A組、D組菌懸液各1mL，涂于初篩培養(yǎng)基平板上，分別進(jìn)行紫外輻照處理12s和8s，于28℃條件下培養(yǎng)24h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，挑取單菌落保藏于斜面培養(yǎng)基，再經(jīng)搖床復(fù)篩，測(cè)突變株輔酶Q10產(chǎn)量。結(jié)果見表3。相同致死率的照射條件下，用1g/L LiCl振蕩處理12h的菌懸液所得的正突變率較高，LiCl在復(fù)合誘變中可以增加菌體的輻射吸收量，滲入細(xì)胞內(nèi)部后效果更加明顯，同時(shí)在誘導(dǎo)菌體向有利方向突變、提高正突變率方面有一定的貢獻(xiàn)。

表3 紫外- LiCl誘變正突變率比較Table 3 Positive mutation rates of Rhizobium leguminosarum after LiCl treatment followed by UV irradiation

通過(guò)羅紅霉素的抗性初篩，以及進(jìn)一步的發(fā)酵復(fù)篩，獲得正突變6株，依次編號(hào)Z01～Z06，其中菌株Z06產(chǎn)量較高，胞內(nèi)輔酶Q10含量為0.565mg/g，較出發(fā)菌株(0.389mg/g)提高了45.2%。

2.3 超聲波誘變

2.3.1 超聲波誘變的豌豆根瘤菌的致死率曲線

由圖3可知，隨著超聲波處理時(shí)間的加長(zhǎng)，豌豆根瘤菌致死率相應(yīng)提高，當(dāng)超聲波誘變時(shí)間為40min時(shí)，致死率達(dá)到97%。目前對(duì)超聲波誘變機(jī)理尚不明了，因此對(duì)超聲波誘變20、30、40min的正突變率都進(jìn)行研究。

圖3 超聲波誘變豌豆根瘤菌的致死率曲線Fig.3 Lethality curve of Rhizobium leguminosarum under ultrasonic treatment

2.3.2 超聲波不同誘變時(shí)間正突變率的比較

表4 超聲波不同誘變時(shí)間正突變率比較Table 4 Positive mutation rates of Rhizobium leguminosarum after ultrasonic treatment for different minutes

超聲波具有很強(qiáng)的生物學(xué)效應(yīng)，其空化作用可產(chǎn)生瞬間高溫和射流等，這足以改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)外發(fā)生物質(zhì)交換，甚至導(dǎo)致突變[13]。由表4可知，超聲波誘變40min時(shí)，該菌正突變率最高，可能是隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲波對(duì)細(xì)胞的作用加強(qiáng)，增加了突變的可能性，因此選擇40min為超聲波誘變條件。經(jīng)過(guò)篩選共得到5株正突變菌株(編號(hào)C40-01～C40-05)，其中C40-05的產(chǎn)量最高，胞內(nèi)輔酶Q10含量為1.198mg/g，比出發(fā)菌株(0.389mg/g)提高了208%。

2.3.3 革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 革蘭氏染色結(jié)果Table 5 Gram staining results

由表5可知，出發(fā)菌株豌豆根瘤菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，呈紫色，得到的10株突變株中4株為革蘭氏陽(yáng)性菌，6株為革蘭氏陰性菌。結(jié)果表明經(jīng)超聲波誘變所得的一部分突變株的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與構(gòu)成發(fā)生變化，與原始出發(fā)菌株有差異，分析與超聲波的空穴作用有關(guān)，隨著超聲波誘變時(shí)間的增加，這種作用隨之增強(qiáng)，增加了突變發(fā)生的幾率。

2.3.4 突變菌株C40-05與原始菌株形態(tài)比較

圖4 豌豆根瘤菌1.1723(×3300)Fig.4 Scan electron micrograph of Rhizobium leguminosarum RL1.1723 (× 3300)

圖5 突變株C40-05(×15000)Fig.5 Scan electron micrograph of Rhizobium leguminosarum C40-05 (×15000)

由圖4、5可知，出發(fā)菌株豌豆根瘤菌1.1723為桿菌，而突變株C40-05菌體形態(tài)接近于橢圓形，與出發(fā)菌株相比，其細(xì)胞大小有顯著變化。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中開通了循環(huán)水并加入適量的冰塊，使超聲波誘變時(shí)菌液處于25～30℃之間，減少了高溫對(duì)菌體的影響，超聲波產(chǎn)生的瞬時(shí)高壓和沖擊力，使菌體細(xì)胞壁受到影響甚至一定程度破壞，造成了菌體細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶出或交換，最終使突變株的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。

2.3.5 突變株C40-05的遺傳穩(wěn)定性

表6 突變株C40-05遺傳穩(wěn)定性Table 6 Genetic stability of Rhizobium leguminosarum C40-05

由表6可知，突變菌株C40-05經(jīng)5次傳代培養(yǎng)，胞內(nèi)輔酶Q10產(chǎn)量維持在1.166～1.195mg/g之間，下降2.67%，表明突變株C40-05的遺傳標(biāo)記和產(chǎn)輔酶Q10的能力穩(wěn)定，可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié) 論

采用紫外-LiCl和超聲波對(duì)豌豆根瘤菌進(jìn)行誘變處理，LiCl質(zhì)量濃度為1g/L，處理時(shí)間為12h，紫外照射時(shí)間為8s，超聲波的處理?xiàng)l件為45kHz、280W，處理時(shí)間40min，經(jīng)過(guò)平板初篩和搖床發(fā)酵復(fù)篩，選育出1株輔酶Q10產(chǎn)量比較高的菌株C40-05，其胞內(nèi)輔酶Q10含量為1.198mg/g，比出發(fā)菌株(0.389mg/g)提高了208%。

[1]TIAN Yuting, YUE Tianli, YUAN Yahong. Improvement of cultivation medium for enhanced production of coenzyme Q10 by photosynthetic Rhodospirillum rubrum[J]. Biochemical Engineering Journal, 2010, 51: 160-166.

[2]丁進(jìn), 宮劍濱. 輔酶Q10對(duì)穩(wěn)定型心絞痛患者運(yùn)動(dòng)耐量的影響[J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志, 2010, 8(4): 398-399.

[3]陸珺, 林潔, 盧家紅. 輔酶Q10在肌肉疾病中的應(yīng)用[J]. 上海醫(yī)學(xué), 2008, 29(12): 554-556.

[4]趙春玉, 趙寶東, 王雅君. 輔酶Q10在帕金森病治療中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)神經(jīng)科雜志, 2003, 36(4): 314.

[5]薛茂云. 輔酶Q10的營(yíng)養(yǎng)作用與應(yīng)用[J]. 營(yíng)養(yǎng)與檢測(cè), 2010, 27(1): 13-16.

[6]JEYA M, MOON H J, LEE J L, et al. Current state of coenzyme Q10 production and its applications[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85 (6): 1653-1663.

[7]李英華. 煙草細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)輔酶Q10的研究[D]. 沈陽(yáng): 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

[8]李焱生, 方建軍, 鐘衛(wèi)鴻. 微生物法高產(chǎn)輔酶Q10的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)報(bào), 2009(2): 59-62.

[9]朱明軍, 江丹. 高產(chǎn)刺糖菌素發(fā)酵菌株的選育[J]. 農(nóng)藥, 2009, 48(8): 571-575.

[10]劉姜, 陳綺莉, 董鑫, 等. 產(chǎn)1,3-丙二醇菌株克雷伯氏肺炎桿菌的誘變與篩選研究[J]. 化工科技, 2009, 17(6): 36-39.

[11]邱雁臨, 梁亮, 汪亮. 紫外線與氯化鋰復(fù)合誘變選育L-組氨酸產(chǎn)生菌[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2008, 24(3): 217-219.

[12]張旭, 張惠文, 徐明愷, 等. 超聲波誘變選育乳鏈菌肽(Nisin)高產(chǎn)菌株[J]. 生物技術(shù), 2009, 19(6): 20-22.

[13]孫波, 張欣, 郭明若, 等. 發(fā)酵乳清產(chǎn)L(+)-乳酸菌株的誘變選育[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2009, 35(5): 50-53.

[14]葉倩文, 盧陸洋, 李新松. 透明質(zhì)酸高產(chǎn)菌株選育研究[J]. 化學(xué)與生物工程, 2010, 27(3): 51-54.

[15]王海燕, 王騰飛, 王瑞明. 基于氯化鋰復(fù)合紫外誘變: 10-HDA高產(chǎn)菌株的篩選[J]. 食品科技, 2007(12): 29-32.

[16]李聚海, 岳田利, 袁亞宏. 皂化法提取胞內(nèi)輔酶Q10的研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2007(3): 14-17.

Induced Mutation Breeding and Screening of a Coenzyme Q10-Producing Strain

CAO Yan-ni，YUE Tian-li*，YUAN Ya-hong，GAO Zhen-peng
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Rhizobium leguminosarum 1.1723 was mutagenized by means of LiCl treatment followed by UV irradiation or ultrasonic treatment alone to yield coenzyme Q10-producing strains. The results showed that 1 g/L LiCl could obviously increase the positive mutation rate and that ultrasonic treatment could change cell wall structure of Rhizobium leguminosarum. A mutant C40-05 with high productivity of coenzyme Q10 was obtained through preliminary screening with roxithromycin and secondary screening by means of shake flask cultivation. Its coenzyme Q10 yield was up to 1.198 mg/g, which revealed a 208% increase compared with the original stain. Only 2.67% reduction in coenzyme Q10 yield of the mutant was observed after the fifth passage. Therefore, the obtained mutant is a stable strain that deserves to be studied further.

Rhizobium leguminosarum；coenzyme Q10；UV-LiCl；ultrasonic；mutagenesis

TS201.3

A

1002-6630(2012)11-0121-05

2011-06-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071550)；農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目(2011-G8-04)

曹燕妮(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锕こ膛c食品安全控制。E-mail：kuteng8705@163.com

*通信作者：岳田利(1966—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锕こ膛c食品安全控制。E-mail：yuetl@nwsuaf.edu.cn