劉 冰，牛 蕓，張德著，張漢波，楊明摯**

（云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650091）

蜜環(huán)菌以菌索的形式侵入天麻營(yíng)養(yǎng)繁殖莖并被同化，是天麻無(wú)性繁殖階段的唯一營(yíng)養(yǎng)源[1]。在生產(chǎn)流程上，天麻種植用蜜環(huán)菌菌種分為三級(jí)：母種 （一級(jí)）、原種 （二級(jí)）和栽培種 （三級(jí)）。從天然環(huán)境中分離純化得到的母種經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)成為生長(zhǎng)旺盛的原種，再接種于固體培養(yǎng)料形成用于轉(zhuǎn)染菌材的栽培種。一級(jí)、二級(jí)菌種的質(zhì)量好壞影響到三級(jí)菌料及菌材上菌索健壯程度及多寡，而后者則直接決定了天麻的質(zhì)量和產(chǎn)量[2]。目前常用固體PDA加富培養(yǎng)基培養(yǎng)母種，蜜環(huán)菌雖能在其基質(zhì)中生長(zhǎng)但存在菌絲易于老化、菌索細(xì)弱長(zhǎng)勢(shì)差等缺點(diǎn)[3]。原種則多采用木屑培養(yǎng)基或液體PDA加富培養(yǎng)基[1-2]。然而目前液體培養(yǎng)方法主要集中于工業(yè)發(fā)酵領(lǐng)域，研究所得的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不適合在天麻種植戶中推廣。本試驗(yàn)擬在現(xiàn)有研究成果上針對(duì)母種及原種培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期篩選出菌絲體性狀優(yōu)良且高產(chǎn)的固體母種配方和適應(yīng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)際的液體原種配方。

1 材料與方法

1.1 材料

直徑1cm及以下板栗細(xì)小枝條 （Castarea mollissima）和玉米芯采自昆明市郊。馬鈴薯購(gòu)自市場(chǎng)，其余試劑類均為國(guó)產(chǎn)分析純。普通型及加富型PDA培養(yǎng)基 （固體型及液體型）配方參考徐錦堂[1]、蘭進(jìn)[2]等。自昭通彝良小草壩采集的腐爛木材韌皮部中分離得到的蜜環(huán)菌 (Armillaria mellea)菌株，利用ITS序列進(jìn)行分子鑒定后，保存于普通PDA培養(yǎng)基上備用。

1.2 方法

1.2.1 母種培養(yǎng)

切取約0.5cm3大小的供試菌株菌塊接種于裝有20 mL加富型固體PDA斜面試管 （18 mm×180 mm）中。25℃恒溫暗箱培養(yǎng)30 d，培養(yǎng)基內(nèi)長(zhǎng)滿白色粗壯菌索后待用。

1.2.2 液體菌種制備

截取高度2 cm上述含菌索母種，盡量剔除附著的半固體培養(yǎng)基后充分剪碎。接種于含125 mL加富型PDA液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中。置于旋轉(zhuǎn)式搖床28℃恒溫、120轉(zhuǎn)·min－1搖瓶培養(yǎng)3 d至菌液呈淺紅色待用。

1.2.3 母種固體培養(yǎng)基正交優(yōu)化

參考彭述敏等[4]、程顯好等[5]的單因素營(yíng)養(yǎng)條件篩選結(jié)果，選取葡萄糖、酵母浸粉和無(wú)水乙醇作為影響因子。設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn) （表1），并按表1配制9個(gè)試驗(yàn)號(hào)的培養(yǎng)基，并設(shè)固體PDA加富培養(yǎng)基為對(duì)照組。滅菌后每20 mL培養(yǎng)基倒入直徑9 cm平板，每試驗(yàn)號(hào)5皿重復(fù)。 每皿接種1.2.2中培養(yǎng) 3 d的液體菌液 0.2 mL并涂布均勻。測(cè)定25℃恒溫培養(yǎng)13 d后的生物量及菌絲體性狀。

表1 正交試驗(yàn)的因素及水平

1.2.4 液體原種培養(yǎng)基制備及優(yōu)化

將原材料在65℃下烘干并剪成1 cm～2 cm的小段。稱取100g原材料碎段，加水1 000 mL煮沸30 min，紗布過濾后滅菌保藏。在100 mL三角瓶中分別添加10 mL、20 mL、30 mL和40 mL板栗枝條煮汁，用普通PDA培養(yǎng)基母液補(bǔ)齊至50 mL。采用玉米芯煮汁和蒸餾水代替上述板栗汁，得到三個(gè)系列四個(gè)梯度 （20%、40%、60%、80%）的培養(yǎng)基，每組三次重復(fù)。121℃高壓滅菌后，每瓶接種1.2.2中培養(yǎng)的液體菌種4 mL。測(cè)定室溫、黑暗條件下?lián)u瓶25天的生物量。比較各組差異，確定原料煮汁的最適添加量。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，在添加劑總量為30 mL下將板栗煮汁和玉米芯煮汁進(jìn)行組合。100 mL三角瓶中分別加入板栗煮汁0、10 mL、15 mL、20 mL和 30 mL，用玉米芯汁補(bǔ)足30 mL。每組再加20 mL普通PDA母液，得到五組不同濃度比 （0∶3、 1∶2、 1∶1、 2∶1、 3∶0）培養(yǎng)基。另設(shè)50 mL液體加富PDA作為對(duì)照，各組均3次重復(fù)。接種菌液4 mL，測(cè)定室溫黑暗搖瓶15 d后菌絲體性狀及生物量。

1.2.5 碳源的選擇優(yōu)化

根據(jù)1.2.3中結(jié)果，用蔗糖等量替換PDA母液中葡萄糖制成PSA母液。在100 mL三角瓶加入30 mL組合添加劑 （板栗液：玉米芯液=1∶1），再分別添加20 mLPDA母液和PSA母液。接種菌液4 mL,測(cè)定室溫黑暗搖瓶15 d后菌絲體特征及生物量。比較不同碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。

1.2.6 菌絲體的生物量測(cè)定方法

固體培養(yǎng)所得單菌落切下置于80℃水浴中5 min，使菌索附著的培養(yǎng)基充分溶解；液體培養(yǎng)所得菌絲球用4層紗布過濾，并用蒸餾水沖掉附著的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)移至已知質(zhì)量的濾紙上，置于65℃烘箱中烘干至恒重，分析天平稱重。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

參考唐啟義等的方法[6]，采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) V3.01進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 母種培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果及分析列于表2和表3。其中干重最高為8號(hào)。極差RC>RB>RA，影響因素主次為：C（乙醇）＞B（酵母膏）＞A（葡萄糖），且C與B之間差異極小。直觀分析最佳組合應(yīng)為A1B3C3。A1B3C3為3號(hào)培養(yǎng)基，但干重不及8號(hào) （A3B2C2）。從生物量角度考慮，最佳組合應(yīng)為A3B2C2 （表2）。

表2 L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果

方差分析顯示，酵母膏、葡萄糖和乙醇對(duì)菌體生長(zhǎng)均無(wú)顯著影響 （FA＜FB＜FC＜F(6,2)0.05）。 同時(shí)誤差平方和SSe過大，占總平方和的32%，推測(cè)三因素之間可能存在交互作用。故無(wú)法用正交方差分析結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化組合（表 3）。

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

將培養(yǎng)基組合做單因素分析，各培養(yǎng)基菌絲體性狀及生物量見表4。8號(hào)、3號(hào)和5號(hào)所得菌絲體干重分列前三位，三者所得菌絲體性狀一致。8號(hào)和3號(hào)的干重與其余各組存在極顯著差異。其余各組間 （含對(duì)照組）菌絲體干重均無(wú)顯著差異，但所得菌絲體的性狀存在差異 （表4）。

2.2 板栗和玉米芯提取液對(duì)蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

不同比例添加劑的培養(yǎng)基在室溫?fù)u瓶培養(yǎng)25 d后獲得的菌絲生物量及其方差分析結(jié)果列于表5。添加同種成分在不同比例間所得菌絲體干重差異極顯著 （F板栗液=684.757＞ F 水 =239.84＞ F 玉 米 芯 液 =181.451＞F(8,3)=8.85）。板栗液比例在20%、40%和60%都對(duì)菌體量增加有極顯著促進(jìn)。玉米芯提取液只有在添加到40%和60%才顯著促進(jìn)菌絲體增重。其中在本次單因素實(shí)驗(yàn)中當(dāng)板栗枝葉提取液添加到60%時(shí)以及玉米芯提取液添加到40%時(shí)對(duì)密環(huán)菌菌絲體生長(zhǎng)促進(jìn)作用分別達(dá)到最大值。比較兩者的促進(jìn)生長(zhǎng)效應(yīng)，在任何添加比例下板栗枝葉提取液對(duì)密環(huán)菌的促生長(zhǎng)作用均顯著優(yōu)于玉米芯提取液 （表5）。

表4 各試驗(yàn)號(hào)菌絲體屬性及方差分析

表5 不同比例的板栗枝葉和玉米芯提取液添加隊(duì)菌絲體生物量的影響

2.3 兩種添加成分組合與優(yōu)化

同時(shí)添加板栗枝和玉米芯提取液，不同比例的混合組合對(duì)密環(huán)菌菌絲體生長(zhǎng)的促進(jìn)作用有差異。其中添加比例為1:1時(shí)的生物量最高，3:0組次之，二者與其它各組均達(dá)到極顯著差異。使用添加劑組合獲得菌球比加富型PDA的個(gè)體更大，在菌球顏色和老化情況方面均有不同程度的差異 （表 6）。

2.4 碳源選擇優(yōu)化結(jié)果

在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別探討了葡萄糖和蔗糖作為碳源的培養(yǎng)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)葡萄糖組和蔗糖組在產(chǎn)量上的差異并不明顯。所得的菌球在個(gè)體大小和數(shù)目都較一致。除蔗糖組的顏色稍淺外，其它特征均與葡萄糖組相同（表7）。

3 討論

伴栽天麻的蜜環(huán)菌菌株宜選擇菌索粗長(zhǎng)、分支多、生物量大、健壯度高的菌株，這樣的菌株侵染機(jī)率高并能長(zhǎng)期供給予天麻充足的營(yíng)養(yǎng)[1]。生產(chǎn)用菌株的質(zhì)量不僅取決于母種的遺傳屬性，還有賴于培養(yǎng)基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)條件。本試驗(yàn)所得最佳固體母種培養(yǎng)基配方 （每升培養(yǎng)基含葡萄糖25 g、 酵母粉 2 g、 乙醇 5 g、 K2PO43g、 MgSO41.5g、 VB110 mg及瓊脂15g）與目前廣泛使用的固體PDA加富培養(yǎng)基相比，菌絲體長(zhǎng)勢(shì)更好，產(chǎn)量達(dá)2倍以上。同時(shí)菌索性狀優(yōu)良，更適合用于天麻栽培；菌絲老化程度低、不易核化，更符合長(zhǎng)期保藏的需求。

彭述敏等[4]的單因素營(yíng)養(yǎng)條件篩選結(jié)果顯示，葡萄糖和酵母膏分別是2株昭通本地天麻共生蜜環(huán)菌生長(zhǎng)的最優(yōu)碳源和氮源。程顯好等[5]發(fā)現(xiàn)向培養(yǎng)基中在適宜的范圍內(nèi)增加乙醇濃度能顯著促進(jìn)蜜環(huán)菌菌絲體產(chǎn)生。Weinhold研究了乙醇作為有機(jī)生長(zhǎng)因子，少量 （0.05%）添加至以0.5%葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上，可以顯著促進(jìn)菌絲的旺盛生長(zhǎng)和菌索的大量產(chǎn)生[7]。由于本試驗(yàn)中各因素間可能存在互作，乙醇對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的促進(jìn)作用可能是影響了蜜環(huán)菌對(duì)葡萄糖或酵母膏的吸收以及菌體內(nèi)的代謝過程。應(yīng)在本試驗(yàn)因素水平上設(shè)計(jì)L18（37）正交試驗(yàn) （增加因素A×B和A×C），確定互作發(fā)生的位置，這對(duì)揭示乙醇的作用機(jī)理有一定意義；并利用正交方差分析確定最高產(chǎn)組合，同時(shí)結(jié)合菌絲體性狀考察，進(jìn)一步優(yōu)化母種配方。

表6 2種添加劑組合對(duì)菌體特征及生物量的影響

表7 不同碳源對(duì)菌絲體特征及生物量影響

二級(jí)菌種的作用是在三級(jí)固體菌料或菌枝上繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。采用液體搖瓶方式培養(yǎng)二級(jí)菌種較之傳統(tǒng)以樹葉木屑為基質(zhì)的固體培養(yǎng)方式，產(chǎn)生的菌絲體生長(zhǎng)點(diǎn)多、菌齡一致，接種于三級(jí)培養(yǎng)料后生長(zhǎng)速度快、分布均勻[1－2]。從生產(chǎn)角度看，液體菌種培養(yǎng)成本低、原料利用率高，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。液體二級(jí)菌種以菌球個(gè)體大，菌絲結(jié)合緊密，健壯度高為優(yōu)。這樣的菌種抵抗不利環(huán)境能力強(qiáng)，在新營(yíng)養(yǎng)條件下的適應(yīng)期短，菌絲萌發(fā)快；同時(shí)單位體積內(nèi)菌絲量多，培養(yǎng)三級(jí)菌料的周期短[8]。

蜜環(huán)菌在自然環(huán)境中往往生長(zhǎng)在殼斗科植物莖干或根部，也有報(bào)道稱采用玉米芯介質(zhì)能成功培養(yǎng)蜜環(huán)菌。板栗提取液中促進(jìn)菌絲體增殖有效成分可能是無(wú)機(jī)鹽類和酚類化合物。蜜環(huán)菌生長(zhǎng)需要大量的錳、磷、鉀和硫元素。自然條件下板栗枝條貯存著較高水平氮 （0.6%）、磷（0.2%）、 鉀 （0.3%）元素以供給果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)積累[9]，在人工施肥情況下含量則更高。果樹韌皮部含有的某些酚類化合物被證實(shí)可以刺激菌索的生成[7]。玉米芯中含58.4%的可溶性碳水化合物和2.0%粗灰分[10]，可作為有效碳源和無(wú)機(jī)鹽的補(bǔ)充。兩種提取液組合使用的效果比單獨(dú)添加好，可能是豐富了營(yíng)養(yǎng)物種類并輔助或刺激了基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物吸收利用。

實(shí)驗(yàn)獲得蜜環(huán)菌液體原種培養(yǎng)基 （每升培養(yǎng)基含馬鈴薯80 g、蔗糖8 g、板栗枝段 30 g、玉米芯碎塊30 g），培養(yǎng)所得菌絲體產(chǎn)量高，菌球數(shù)目多、個(gè)體大、健壯度高。在各指標(biāo)上均優(yōu)于目前常用的加富型PDA液體配方，同時(shí)節(jié)約馬鈴薯和糖各60%。該配方成本低、原料易得、操作簡(jiǎn)單，適合用于實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。板栗是云南省廣泛栽培的經(jīng)濟(jì)作物，每年因避免果樹徒長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生大量的修剪枝條。玉米芯也是廣泛而廉價(jià)的原料來(lái)源。而這部分農(nóng)業(yè)廢棄物由于可利用力面窄，往往用于焚燒供能。蔗糖較之葡萄糖，價(jià)格便宜且易獲得，種植戶在實(shí)際生產(chǎn)中可以使用食用白糖代替。天麻種植戶利用上述原料培養(yǎng)蜜環(huán)菌液體菌種，可以成本降低并獲得較高質(zhì)量的菌株，同時(shí)實(shí)現(xiàn)廢物利用，減少對(duì)環(huán)境的污染危害。

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