孫 露，姚方杰,2**，方 明

（1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2食藥用菌教育部工程研究中心，長(zhǎng)春 130118）

原生質(zhì)體技術(shù)是為食用菌細(xì)胞生物工程育種提供了新技術(shù)，在食用菌育種中具有明顯的開拓性[1、2]。在木耳屬中大量栽培的有木耳和毛木耳2個(gè)種，但是有關(guān)原生質(zhì)體的研究卻多集中于栽培量最大的木耳上，而對(duì)產(chǎn)量?jī)H次于木耳的毛木耳的研究卻較少[3－6]。本試驗(yàn)對(duì)影響毛木耳原生質(zhì)體制備與再生的若干條件進(jìn)行研究，旨在建立起最佳的毛木耳原生質(zhì)體制備、再生體系，為進(jìn)一步開展毛木耳等木耳屬食用菌的遺傳育種研究提供技術(shù)支持。

1 供試菌株

供試菌株由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院提供 （由云南農(nóng)科院采集于云南省西雙版納傣族自治州勐臘縣內(nèi)山區(qū)）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化

采用SMY液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲。

分別設(shè)置4個(gè)培養(yǎng)時(shí)間、4個(gè)酶解溫度、5個(gè)酶解時(shí)間、5個(gè)融壁酶濃度、4種滲透壓穩(wěn)定劑及其4濃度進(jìn)行原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化研究。

菌絲培養(yǎng)及原生質(zhì)體制備參照木耳[4]。

2.2 原生質(zhì)體再生條件 （培養(yǎng)基）的優(yōu)化

設(shè)計(jì)3個(gè)配方篩選最佳再生培養(yǎng)基。即在基本配方（馬鈴薯 200g、 葡萄糖 20 g、 蛋白胨 2 g、 MgSO40.5 g、K2HPO41 g、 KH2PO40.46 g、 VB110 mg、 瓊脂 15 g/8 g、 水1 000 mL）內(nèi)加入 0.5M MgSO4的為 RM1 （MgSO4）， 0.5M甘露醇的為RM2（甘露），0.5M蔗糖RM3（蔗糖）。

3 結(jié)果與分析

3.1 出發(fā)菌齡

菌株的生理狀態(tài)是影響其原生質(zhì)體化的內(nèi)在因素，其中菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備的影響尤為明顯。本試驗(yàn)選擇培養(yǎng)4 d~7 d的幼齡菌絲體進(jìn)行試驗(yàn)，制得原生質(zhì)體數(shù)量由多到少順序?yàn)? d＞6 d＞4 d＞7 d，如圖1。毛木耳菌株培養(yǎng)5 d時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量最大達(dá)到1.0×107個(gè)·ml-1。

圖1 不同菌齡制得原生質(zhì)體數(shù)量Figure 1 Protoplast number of different cell ages

3.2 融壁酶濃度

根據(jù)不同的食用菌種類及細(xì)胞壁成分應(yīng)選擇相應(yīng)的融壁酶。本試驗(yàn)選用廣東微生物所產(chǎn)的融壁酶，制備效果較好。如圖2，原生質(zhì)體數(shù)量由多到少順序?yàn)?.5%＞2%＞1%＞2.5%＞3%。融壁酶濃度為1.5%時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量最大達(dá)到1.11×107個(gè)·mL-1。隨著酶濃度的增大，原生質(zhì)體產(chǎn)量有先上升后下降的趨勢(shì)。因此，毛木耳原生質(zhì)體制備的最佳的酶濃度為1.5%。

圖2 不同融壁酶濃度制得原生質(zhì)體數(shù)量Figure 2 Protoplast number of different enzyme concentration

3.3 酶解溫度及酶解時(shí)間

酶解溫度和酶解時(shí)間是影響原生質(zhì)體產(chǎn)量的兩個(gè)重要因素。本試驗(yàn)選擇25℃、30℃、35℃、40℃四個(gè)溫度進(jìn)行試驗(yàn)，原生質(zhì)體產(chǎn)量如圖3。隨著酶解溫度的升高，原生質(zhì)體產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在30℃時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最大值 1.04×107個(gè)·mL-1。

不同酶解的時(shí)間，會(huì)有不同的位置發(fā)生酶解，因此所得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量及生理活性也不一樣,如圖4。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體產(chǎn)量也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，酶解3 h時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最大值9.6×106個(gè)·mL-1。酶解時(shí)間再延長(zhǎng)反而會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體產(chǎn)量的下降。因此，毛木耳原生質(zhì)體制備的最佳酶解溫度為30℃，酶解時(shí)間為3 h。

3.4 滲透壓穩(wěn)定劑種類及濃度

圖3 不同酶解溫度制得原生質(zhì)體數(shù)量Figure 3 Protoplast number of different enzymatic hydrolysis tem perature

圖4 不同酶解時(shí)間制得原生質(zhì)體數(shù)量Figure 4 Protoplast number of different enzymatic hydrolysis time

圖5 不同滲透壓穩(wěn)定劑制得原生質(zhì)體數(shù)量Figure 5 Protoplast number of different osmotic stabilizer

圖6 不同滲透壓穩(wěn)定劑濃度制得原生質(zhì)體數(shù)量Figure 6 Protoplast number of different osmotic stabilizer concen tration

由圖5、圖6看出，利用不同滲透壓穩(wěn)定劑制得的原生質(zhì)體數(shù)量由多到少為甘露醇＞MgSO4＞蔗糖＞KCl。甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑，濃度為0.5 M時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量高達(dá)1.02×107個(gè)·mL－1。 圖 7 為供試菌株在最佳原生質(zhì)體制備條件下得到的原生質(zhì)體。

圖7 毛木耳原生質(zhì)體 (40倍)Figure 7 Protoplasts of Auricularia polytricha (40 times)

3.5 再生培養(yǎng)基類型

在三種再生培養(yǎng)基中，RM1（MgSO4）的再生菌落極少，再生率幾乎為0；RM2（甘露醇）的再生菌落較多，再生率為0.196%；RM3（蔗糖）的再生菌落最多 （如圖8），再生率為1.144%。因此，RM3為毛木耳原生質(zhì)體的最佳再生培養(yǎng)基。

4 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，毛木耳原生質(zhì)體制備的最佳條件：菌齡5d；融壁酶濃度為1.5%，酶解溫度30℃，酶解時(shí)間3h；滲透壓穩(wěn)定劑選擇甘露醇，濃度為0.5 M。在最佳酶解條件下， 原生質(zhì)體數(shù)量可達(dá)到 1.1×107個(gè)·mL－1。

最適再生培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋 白 胨 2 g， MgSO40.5 g， K2HPO41 g， KH2PO40.46 g，VB110 mg， 瓊脂 15g/8 g， 0.5M 蔗糖,水 1 000 mL。

圖8 原生質(zhì)體再生菌落Figure 8 Protoplast regeneration

但是，與其它食用菌相比，毛木耳原生質(zhì)體的再生率較低，在最佳制備及再生條件下僅為1.144%。這可能是由于毛木耳菌絲生長(zhǎng)速度較慢造成的。有研究表明，食用菌原生質(zhì)體再生率與其生長(zhǎng)速度成正相關(guān)，生長(zhǎng)速度慢的再生率也低，受其自身的遺傳特性的影響

[1]劉祖同，羅信昌.食用蕈菌生物技術(shù)及應(yīng)用[M].北京：清華大學(xué)出版社，2002.

[2]李守勉，李明，刑蕾，等.食用菌原生質(zhì)體技術(shù)應(yīng)用的研究 [J].安徽農(nóng)業(yè)科 2007， 35(25):7770－7771.

[3]姚方杰，張友民，陳影.我國(guó)黑木耳產(chǎn)業(yè)發(fā)展形勢(shì) [J].北方園藝,2010， 18:209－211.

[4]羅信昌.光木耳和毛木耳原生質(zhì)體的形成和再生 [J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1987， 6(2):189－191.

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