姜 玢， 孫國(guó)祥

（1.鞍山市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧鞍山114006；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110016）

中國(guó)林蛙卵油HPLC數(shù)字化指紋圖譜研究

姜 玢1， 孫國(guó)祥2*

（1.鞍山市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧鞍山114006；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110016）

目的 建立中國(guó)林蛙卵油 （Forest Frogs Oviduct）HPLC數(shù)字化指紋圖譜。方法 采用反相HPLC法以Century SIL C18BDS柱 （250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水-磷酸 （80∶20∶0.15），檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫 （35.0±0.15）℃，進(jìn)樣量20 μL。用“中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)系統(tǒng)3.0”軟件進(jìn)行數(shù)字化評(píng)價(jià)。結(jié)果 以亞油酸 （Linoleate）為參照物峰，確定21個(gè)指紋峰，獲得了可以判別其質(zhì)量的重要數(shù)字化信息，并以系統(tǒng)指紋定量法鑒別出S7、S10質(zhì)量極好，其余批次的質(zhì)量等級(jí)為很好。結(jié)論 所建立的中國(guó)林蛙卵油HPLC數(shù)字化指紋圖譜方法穩(wěn)定、可靠，可用于中國(guó)林蛙卵油的質(zhì)量控制。

中國(guó)林蛙卵油；HPLC數(shù)字化指紋圖譜；超信息特征；系統(tǒng)指紋定量法；統(tǒng)一化色譜指紋圖譜

中國(guó)林蛙Rana temporaria chensinesisDavid是兩棲綱無(wú)尾目蛙科蛙屬動(dòng)物，俗稱哈士蟆，其雌蛙的干燥輸卵管稱為林蛙油。中國(guó)林蛙卵油為取蛙油剩余的卵經(jīng)超臨界萃取而得。中國(guó)林蛙卵油主含不飽和脂肪酸等，含有18種氨基酸，其中必需氨基酸的總量為28.93%；富含雌二醇與磷脂；含有維生素A、D、E、C等及人體必需的微量元素及多種微量元素［1-4］。目前對(duì)中國(guó)林蛙卵油的研究多集中在成分研究和藥理作用的研究，質(zhì)量控制研究仍然不足。作者已經(jīng)對(duì)中國(guó)林蛙卵油進(jìn)行氣相色譜的指紋圖譜研究［5］，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)中國(guó)林蛙卵油進(jìn)行指紋圖譜研究，以期建立完整的指紋圖譜體系。中藥指紋圖譜技術(shù)作為全面控制中藥質(zhì)量的有效手段已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)同，中藥指紋學(xué)體系也日益完善。數(shù)字化指紋圖譜是利用數(shù)學(xué)原理或數(shù)學(xué)方法對(duì)指紋圖譜本質(zhì)特征進(jìn)行定義、表達(dá)、重組、模擬、信息挖掘等處理的系統(tǒng)加工過(guò)程［6］。本試驗(yàn)采用HPLC法對(duì)中國(guó)林蛙卵油進(jìn)行質(zhì)量控制，建立中國(guó)林蛙卵油高效液相色譜數(shù)字化指紋圖譜，并采用系統(tǒng)指紋定量法對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，為中國(guó)林蛙卵油的全面質(zhì)量控制提供一種新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑 Agilent 1100型液相色譜儀 （配有二極管陣列檢測(cè)器、低壓四元梯度泵、在線脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器），ChemStation工作站 （Agilent科技有限公司），RE52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海亞榮生化儀器廠），Sarturius-BS110S分析天平 （北京賽多利斯天平有限公司），KDM型控溫電熱套 （山東鄄城華魯儀器公司）。乙腈 （色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠），丙酮 （分析純，康科德科技有限公司），磷酸 （色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心），亞油酸 （供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所），水為去離子水。微孔濾膜 （0.45 μm×25 mm，上海興亞凈化材料廠）。10批中國(guó)林蛙卵油均產(chǎn)自中國(guó)撫順（分別標(biāo)注為S1～S10），采用CO2超臨界萃取而得，經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)徐峰老師鑒定均為正品。

1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取亞油酸對(duì)照品102 mg，置25 mL量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

1.3 供試品溶液制備 精密稱取中國(guó)林蛙卵油1.50 g，置50 mL量瓶中，加適量丙酮超聲10 min使溶解，以丙酮定容至刻度，搖勻，放置12 h，過(guò)濾。精密量取濾液25 mL減壓蒸干丙酮，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解并定容至25 mL，搖勻，過(guò)濾，作為供試品溶液，進(jìn)樣前用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.4 色譜條件 色譜柱：大連江申CenturySIL C18BDS（250 mm ×4.6 mm，5 μm），乙腈-水-磷酸 （80 ∶20 ∶0.15）為流動(dòng)相。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫 （35.0±0.15）℃，進(jìn)樣量 20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件選擇 試驗(yàn)中測(cè)試了沈陽(yáng)辰陽(yáng)Chromarex C18ODS（20 cm×4.6 mm，5 μm）和大連江申CenturySIL C18BDS（25 cm×4.6 mm，5 μm）兩種類型色譜柱；以205 nm、210 nm、220 nm、280 nm和320 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行試驗(yàn)，考察了3種流動(dòng)相系統(tǒng) （1）甲醇-水、 （2）乙腈-水、（3）乙腈-水 （含0.15%磷酸）；分別以丙酮、三氯甲烷、丙酮-流動(dòng)相為溶劑提取供試品；根據(jù)色譜圖分離結(jié)果，決定采用丙酮和流動(dòng)相系統(tǒng)處理樣品，選用大連江申CenturySIL C18BDS（25 cm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-水-磷酸 （80∶20∶0.15）為流動(dòng)相，選擇210 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取樣品供試液20 μL進(jìn)樣和亞油酸對(duì)照品1 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。比較保留時(shí)間可確定15.58 min為亞油酸，其與相鄰峰均達(dá)到基線分離，保留時(shí)間適中，可作為參照物峰。在此系統(tǒng)條件下，測(cè)得該峰的理論板數(shù)應(yīng)不低于16 000?？疾? h基線和供試品2 h圖，結(jié)果系統(tǒng)無(wú)干擾且確定測(cè)定時(shí)間為30 min。

2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取S1號(hào)中國(guó)林蛙卵油樣品供試液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖。以19號(hào)峰 （亞油酸）的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%；相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%。表明系統(tǒng)進(jìn)樣精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1號(hào)樣品平行制備5份供試液，精密吸取20 μL在HPLC儀上進(jìn)樣并檢測(cè)，記錄色譜圖。以亞油酸峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，結(jié)果各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%；相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1號(hào)中國(guó)林蛙卵油供試液，分別在制備樣品后的0、4、8、12 h和16 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%；相對(duì)峰面積的RSD除7號(hào)峰 （RSD=3.81%）外，均小于3.0%，表明樣品在16 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 中國(guó)林蛙卵油HPLC指紋圖譜建立 將10批中國(guó)林蛙卵油供試液分別注入色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2。以19號(hào)峰 （亞油酸）為參照物峰，按共有峰出現(xiàn)率100%計(jì)，確定共有峰為21個(gè)。將積分信號(hào)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)系統(tǒng)3.0”軟件［7］按平均值法計(jì)算生成對(duì)照指紋圖譜 （RFP）見(jiàn)圖2。方向余弦平方cos2Y2+cos2Y13=0.59，表明2號(hào)峰與13號(hào)峰對(duì)SF貢獻(xiàn)為最大，起決定性作用。對(duì)照指紋圖譜特征技術(shù)參數(shù)見(jiàn)表1。

圖2 10批中國(guó)林蛙卵油HPLC指紋圖譜及RFP

2.7 中國(guó)林蛙卵油HPLC指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)［8］目前，中藥指紋圖譜的研究多停留在方法的研究，而建立方法后，對(duì)指紋圖譜的評(píng)價(jià)是指紋圖譜得到應(yīng)用的重要一環(huán)。中國(guó)林蛙卵油HPLC指紋圖譜的評(píng)價(jià)采用孫國(guó)祥等開發(fā)的“中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)系統(tǒng)3.0”軟件，評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，本方法得到的指紋圖譜各指紋峰分離到基本達(dá)到基線分離 （基線分離峰對(duì)兒數(shù)m、有效分離率β及ˉR分別為19～20、0.95～1.00及5.1～5.8），峰間等距性較好 （分離度均化系數(shù)τ=0.811～0.840），有良好的信號(hào)均化性；峰面積參數(shù)（∑Ai、A_avg、A_geo）及平均峰高參數(shù)ˉH，表明個(gè)指紋峰信號(hào)較強(qiáng)。指紋峰柱效參數(shù) （W_avg、N）表明獲得較高柱效。F（指紋圖譜指數(shù)）=29.0～32.1，I（指紋圖譜信息量指數(shù)）=14.8～15.6，均表明中國(guó)林蛙卵油指紋圖譜絕對(duì)指數(shù)處于中等水平；Fr（指紋圖譜相對(duì)指數(shù)）=64.2～76.1，Ir（相對(duì)信息量指數(shù)）=31.0～36.3，比較可知Fr大于F而Ir大于I。對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行校正后得指數(shù)Fr（t）和Ir（t），二者與原Fr和Ir值相近，說(shuō)明時(shí)間效率不突出；對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行校正后得指數(shù)Fr（q）和Ir（q），二者均高于原來(lái)F和I值，說(shuō)明樣品所含化學(xué)信息量很高。綜合考慮，質(zhì)控時(shí)，F(xiàn)、Fr、I和Ir應(yīng)分別不低于29、62、14和31。

表1 中國(guó)林蛙卵油HPLC對(duì)照指紋圖譜特征技術(shù)參數(shù)

2.8 系統(tǒng)指紋定量法鑒定中國(guó)林蛙卵油質(zhì)量［9］在對(duì)指紋系統(tǒng)定性分析合格基礎(chǔ)上，再對(duì)系統(tǒng)指紋進(jìn)行整體定量分析，用Sm、Pm和α相結(jié)合來(lái)鑒定中藥質(zhì)量的方法稱為系統(tǒng)指紋定量法。系統(tǒng)指紋定量法是對(duì)指紋系統(tǒng)的量化評(píng)價(jià)，具有較高實(shí)用性，可操作性更強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。其中Sm稱為宏定性相似度，Pm稱為宏定量相似度，兩者能夠整體監(jiān)測(cè)化學(xué)指紋整體含量；指紋均化性變動(dòng)系數(shù)用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差α表示。以對(duì)照指紋圖譜為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算10批中國(guó)林蛙卵油的Sm、Pm和α并判定其質(zhì)量，見(jiàn)表3。樣品中S7和S10質(zhì)量級(jí)別為極好，其余批次均為很好。

2.9 中國(guó)林蛙卵油統(tǒng)一化HPLC指紋圖譜［10-11］為增強(qiáng)指紋圖譜的通用性和實(shí)用性，實(shí)現(xiàn)同類型色譜在相同實(shí)驗(yàn)條件下，采用不同儀器檢測(cè)系統(tǒng)而獲得的分析結(jié)果的直接比對(duì)，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用孫國(guó)祥等研發(fā)的“中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)系統(tǒng)3.0”對(duì)圖譜進(jìn)行了統(tǒng)一化參量評(píng)價(jià)，建立了中國(guó)林蛙卵油統(tǒng)一化HPLC指紋圖譜指數(shù)圖譜，相對(duì)統(tǒng)一參數(shù)見(jiàn)表4，圖譜見(jiàn)圖3，從多維數(shù)字化角度揭示了與中國(guó)林蛙卵油相關(guān)的RP-HPLC指紋圖譜的特征，為采用其它儀器系統(tǒng)所得的指紋圖譜的評(píng)價(jià)提供了依據(jù)。色譜指紋圖譜定信號(hào)指數(shù)Ft/a是將各指紋峰均視為最大峰 （均化系數(shù)γ=1），有效分離率和峰等距性都為最佳時(shí)ra統(tǒng)一化相對(duì)積分和B值 （與和 ξ很相關(guān)），從總體上反映各指紋峰rai=1時(shí)rti擴(kuò)展程度大小，；Fα/t是用來(lái)考察當(dāng)各峰都定點(diǎn)于最末峰位置且有效分離率、信號(hào)均化性為最佳時(shí)需要V增大的程度 （與V具有最大相關(guān)性），F(xiàn)t/a和Fα/t值均越小越好。結(jié)果顯示，兩者均以S3最小，表明其圖譜達(dá)到理想狀況最容易，原指紋圖譜最理想。

表2 中國(guó)林蛙卵油HPLC指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)結(jié)果

表3 系統(tǒng)指紋定量法評(píng)價(jià)中國(guó)林蛙卵油質(zhì)量結(jié)果

表4 中國(guó)林蛙卵油HPLC色譜指紋圖譜相對(duì)統(tǒng)一參數(shù)

圖3 中國(guó)林蛙卵油統(tǒng)一化HPLC指紋圖譜

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了中國(guó)林蛙卵油的HPLC數(shù)字化指紋圖譜，應(yīng)用“中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)系統(tǒng)3.0”軟件從HPLC指紋圖譜超信息信息特征、相對(duì)統(tǒng)一化特征評(píng)價(jià)10批中國(guó)林蛙卵油，結(jié)合系統(tǒng)指紋定量法有效地鑒別其質(zhì)量。方法穩(wěn)定、可靠，重現(xiàn)性好，為中國(guó)林蛙卵油的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法提供了新的參考依據(jù)。

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R284.1

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1001-1528（2012）06-1183-06

2011-07-11

姜 玢 （1973—），女，碩士，副主任中藥師，從事中成藥及中藥材質(zhì)量控制。Tel：（0412）5813298，E-mail：pipi-jiangbin@sohu.com