孟 姝， 林玉蓮

（1.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，江蘇鹽城224005；2.江蘇省鹽城藥品檢驗(yàn)所，江蘇鹽城 224002）

采用TLC和HPLC法檢查利膽片中的土大黃苷

孟 姝1， 林玉蓮2

（1.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，江蘇鹽城224005；2.江蘇省鹽城藥品檢驗(yàn)所，江蘇鹽城 224002）

目的 建立TLC結(jié)合HPLC法檢查利膽片中的土大黃苷的檢測(cè)方法；方法 采用硅膠G板，乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水 （10∶7∶1∶1）為展開劑，在365 nm下檢視；以C18柱為色譜柱，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-水 （20∶80）為流動(dòng)相，采用二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為328 nm。結(jié)果 利膽片非法摻入的土大黃的指標(biāo)性成分土大黃苷在365 nm下顯持久的藍(lán)紫色熒光斑點(diǎn)。通過高效液相色譜法進(jìn)一步驗(yàn)證。對(duì)53批市售的利膽片進(jìn)行篩查，檢出土大黃苷的利膽片有26批。結(jié)論 TLC結(jié)合HPLC法簡(jiǎn)便，快速，專屬性強(qiáng)，能有效地檢查利膽片是否摻入土大黃。

利膽片；土大黃苷；TLC；HPLC

利膽片是江蘇省基本藥物目錄收載的品種，主要由大黃、金銀花、金錢草、木香、知母、大青葉、柴胡、白芍、黃芩、芒硝、茵陳等十一味組成的純中藥制劑，具有清熱止痛作用。用于膽道疾患，脅肋及胃腹部疼痛，按之痛劇，小便短黃，身熱頭痛，嘔吐不食等癥［1］。而該處方中大黃具有瀉熱通暢，涼血解毒逐瘀痛經(jīng)的作用［2］，對(duì)利膽片的主要功效貢獻(xiàn)重大。而目前市場(chǎng)上經(jīng)常發(fā)現(xiàn)有的藥品生產(chǎn)企業(yè)，在投料過程中，用同屬一些植物 （在部分地區(qū)或民間稱山大黃或土大黃）代替大黃的現(xiàn)象，他們除了價(jià)格比大黃便宜外，藥效與大黃也有很大差別，瀉下作用很弱，通常外用為收斂止血藥，或作獸藥和工業(yè)染料，造成此類制劑質(zhì)量存在隱患，療效不一［3］。這些代用品一個(gè)共同特點(diǎn)是均含有土大黃苷，鑒于對(duì)大黃中土大黃苷的檢查方法的研究［4-5］，本實(shí)驗(yàn)建立土大黃苷的薄層色譜法和高效液相色譜法的檢測(cè)方法，以判斷利膽片原料藥材料的真?zhèn)?。結(jié)果發(fā)現(xiàn)53批樣品中，有26批次12個(gè)批號(hào)的樣品中檢出土大黃苷。

1 土大黃苷薄層色譜法檢查

1.1 儀器與試藥 CAMAG薄層色譜系統(tǒng)。供試品：市售利膽片53批次、23個(gè)批號(hào)，其中A企業(yè)2批次、1個(gè)批號(hào)，B企業(yè)14批次、5個(gè)批號(hào)，C企業(yè)35批次、16個(gè)批號(hào)，D企業(yè)2批次、1個(gè)批號(hào)；所用試劑均為分析純；對(duì)照品：土大黃苷 來源：中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110794-200504。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 方法 取供試品5片，除去包衣，研細(xì)，置錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲15 min，濾過，濾液回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。另取土大黃苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法［6］試驗(yàn)，吸取供試品溶液1 μL，對(duì)照品溶液2 μL分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水 （10∶7∶1∶1）為展開劑，展開后，取出，晾干，置紫外燈 （365nm）下觀察。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)不得顯相同持久藍(lán)紫色的熒光斑點(diǎn)。

1.2.2 結(jié)果 53批樣品中有13個(gè)批號(hào) （1～3號(hào)板中T1、T5、T6、T7、T8、T9、T13、T15、T16、T17、T18、T20、T23）檢出與土大黃苷對(duì)照品顯相同的持久亮藍(lán)紫色的熒光斑點(diǎn)。另將相同批號(hào)、不同地點(diǎn)抽取的樣品集中重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果均顯持久亮藍(lán)紫色的熒光斑點(diǎn) （4號(hào)板）。對(duì)于上述疑似檢出土大黃苷的樣品，將繼續(xù)用高效液相色譜法進(jìn)一步確證。見圖1。

圖1 利膽片土大黃苷薄層色譜圖

2 土大黃苷高效液相色譜法檢查

2.1 儀器與試藥 儀器：Waters2695/2994HPLC、BP-211D電子天平，對(duì)照品同上。

2.2 方法和結(jié)果

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水 （20∶80）為流動(dòng)相；采用二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為328 nm。理論板數(shù)按土大黃苷峰計(jì)應(yīng)不低于2 500，掃描波長(zhǎng)為280～400 nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取土大黃苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品5片，除去包衣，研細(xì)，置錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲20 min，放冷，搖勻，用微孔濾膜 （0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 測(cè)定法和結(jié)果判斷 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品色譜中，應(yīng)不得出現(xiàn)與對(duì)照品色譜保留時(shí)間相同的色譜峰。若出現(xiàn)保留時(shí)間相同的色譜峰，其在280～400 nm波長(zhǎng)范圍的紫外-可見吸收光譜應(yīng)與對(duì)照品不相同。必要時(shí)可采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法驗(yàn)證。

2.2.5 結(jié)果 在檢測(cè)波長(zhǎng)為328 nm處提取的色譜圖中，有12批樣品中均出現(xiàn)與土大黃苷對(duì)照品保留時(shí)間 （6.9 min）相同的色譜峰，且在280～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外-可見吸收光譜圖亦與對(duì)照品相同，其最大吸收峰均為 （325±2）nm，見圖2～3。而薄層色譜中T9在檢測(cè)波長(zhǎng)為328 nm的色譜圖中未出現(xiàn)與土大黃苷對(duì)照品相同的色譜圖，在280～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外-可見吸收光譜圖亦不同，則可以排除其含有土大黃苷，見圖4。最終確認(rèn)檢出土大黃苷共有26個(gè)批次12個(gè)批號(hào)，均為C企業(yè)生產(chǎn)，其三維分析比較結(jié)果表1。

圖2 供試品 （T7-C企業(yè)091005）（A）及土大黃苷對(duì)照品 （B）HPLC色譜圖 （328 nm）

2.2.6 為了進(jìn)一步確認(rèn)上述的檢測(cè)結(jié)論，我們隨機(jī)抽取表1中C企業(yè)的3批樣品，采用HPLC/MS進(jìn)行驗(yàn)證。

儀器 瓦里安液質(zhì)聯(lián)用儀1200L、BP-211D電子天平，對(duì)照品同上。色譜條件：色譜柱XB-C183 μm 2.1 mm×100 mm；體積流量0.2 mL/min；流動(dòng)相乙腈-水 （20：80）；進(jìn)樣量 S 5 μL T 2 μL。

質(zhì)譜條件：離子源 ESL（電噴霧離子源）；主氣體393 kPa；指針5 kV；干燥氣體138 kPa；屏蔽電壓600 V；噴霧氣壓359 kPa；毛細(xì)管電壓100 V；箱溫40℃；檢測(cè)電壓5 kV；干燥氣溫280℃；掃描方式MRM；離子對(duì)421.1/259.2。結(jié)果，上述供試品均在對(duì)照品相同保留時(shí)間處出現(xiàn)相同的色質(zhì)譜峰。

圖3 供試品 （T7-C企業(yè)091005）（A）及土大黃苷對(duì)照品 （B）DAD光譜圖 （280～400 nm）

圖4 T9樣品的HPLC色譜和DAD光譜圖

表1 供試品及土大黃苷對(duì)照品HPLC三維色譜及光譜比較

3 討論

3.1 在TLC檢查土大黃苷的過程中，曾以三氯甲烷-甲醇-甲酸-水 （10∶30.5 ∶0.2 ∶0.3）等多種展開劑［7-8］進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，效果都不太理想。另將上述層析板置室溫下保存，并分別在2、4、8、12 h和24 h時(shí)，置紫外燈 （365 nm）下觀察與土大黃苷對(duì)應(yīng)的熒光斑點(diǎn)顏色變化情況，13批顯對(duì)應(yīng)熒光斑點(diǎn)的樣品中，除了T9的熒光斑點(diǎn)逐漸減弱至4 h就不清楚了，其余12批一直清晰可見，這一結(jié)果與HPLC法的檢查結(jié)果是一致的。

3.2 通過TLC和HPLC法對(duì)土大黃苷的檢查，53批樣品中檢出26批次 （12個(gè)批號(hào)）含有土大黃苷，且均是C廠生產(chǎn)的樣品，其余3個(gè)廠家均未檢出，說明該企業(yè)對(duì)原料藥材的質(zhì)量控制方面存在很大的漏洞，其質(zhì)量管理體系是存在一定問題的。

3.3 土大黃苷主要存在于與大黃同屬的多種植物藏邊大黃Rheum emodiWall.，河套大黃R.hotaoenseC.Y.Chenget C.T.Kao，華北大黃R.franzenbachiiMunt.及天山大黃R.wittrochiiLundstr.［9］等根和根莖中，這些被民間稱之為土大黃或者山大黃的代用品，其瀉下作用很弱，通常外用為收斂止血藥，或作獸藥和工業(yè)染料，因?yàn)槠鋬r(jià)格便宜，市場(chǎng)經(jīng)常出現(xiàn)用其冒充大黃使用，而大黃主要是攻積滯，清濕熱，瀉火，涼血，祛瘀，解毒等功效［10］。這樣會(huì)嚴(yán)重影響處方或中成藥制劑的功效的，甚至?xí)鹣喾吹淖饔?，所以建議利膽片制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增補(bǔ)土大黃苷的檢測(cè)。在本次實(shí)驗(yàn)過程中，53批樣品就檢出26批含有土大黃苷，檢出率占49%；若不計(jì)算同批號(hào)樣品，23批樣品中就有12批檢出土大黃苷，檢出率占52%；對(duì)于同一個(gè)生產(chǎn)企業(yè)來講，占的比例就更高了，所以說在利膽片中增加土大黃苷的檢查是非常有必要的。

致謝：南京市藥品檢驗(yàn)所協(xié)助作HPLC/MS的驗(yàn)證。

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R927.1

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1001-1528（2012）06-1193-04

2011-05-26

孟 姝 （1985—），女，助教，碩士，研究方向：藥物分析。Tel：13770020681，E-mail：mengshu1985@163.com

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