祖 晶,劉建軍

(1.淮陰師范學院體育學院,江蘇 淮安 223300;2.上海對外貿易學院體育部,上海 201600)

血管內皮細胞具有產生舒縮血管活性物質,調節(jié)血管張力的功能,內皮源性舒張因子主要有一氧化碳(nitric oxide NO),前列環(huán)素(prostacyclin,PGI2)以及內皮依賴性超極化因子(endothelium derived hyperpolarizing factor,EDHF)等 ,血管內皮源性收縮和舒張因子是否平衡直接影響了血管張力。動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié)是血管內皮的損傷,運動訓練是改善心血管健康,預防和輔助治療動脈粥樣硬化的有效手段。目前認為有氧運動改善心血管健康主要通過NO途徑實現,但確切機制并不十分清楚,直接測定有氧運動對動脈反應的研究不多,更少有同時測定對動脈3條舒張途徑的影響。本實驗測定有氧運動后,大鼠胸主動脈經NO、PGI2途徑以及 EDHF途徑舒張功能的改變,探討有氧運動對大鼠胸主動脈舒張影響的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

8周大的雄性SD大鼠12只,由復旦大學醫(yī)學院動物研究所提供,體重250～270g,常規(guī)飼養(yǎng),室溫控制在19～23℃,光照-黑暗周期為12 h/12 h,每天適應性游泳訓練15 min,每周5次,適應性訓練一周后隨機分成2組(n=6),分為常氧不運動組(N)、常氧訓練組(EX)。EX組進行8周的游泳訓練 ,每次 1 h,每周5次。

1.2 儀器與試劑

HV-4離體組織器官恒溫灌流系統,BL-420E+生物機能實驗系統,張力換能器(JH-2,10g),TG L-16G型臺式高速冷凍離心機。

苯腎上腺素(phenylephrine,PE),乙酰膽堿(acetylcholine,Ach),L-N-硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine Methyl Ester,LNAME),吲哚美辛(indomethacin,Indo),二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、apamin、charybdotoxin均為美國 Sigma公司產品。其余試劑購自南京德寶生化器材有限公司。除Indo先用DMSO初溶,其余均用K-H液溶解,所有試劑使用前用 KH液稀釋。

K-H緩沖液(mmol/L)組成:NaCl 118,NaHCO325,KCl 4.8,MgCl21.2,KH2PO41.2,CaCl22.5,G lucose 11.7,溶液均為新鮮配制。

1.3 分離動脈環(huán)

在規(guī)定的運動訓練完成后,2組大鼠分別予腹腔內注射水合氯醛麻醉處死,立即行開胸分離出心臟,放置在 K-H緩沖液中,剪開心包膜,分離出胸主動脈,于主動脈弓下0.5 cm處切下1段2 mm長的胸主動脈環(huán)(內徑不小于1.0mm),不能過分牽拉血管,以確保內皮的完整。

1.4 胸主動脈環(huán)收縮-舒張反應系統的建立

器官浴槽中盛有5 ml的pH 7.4,37℃K-H緩沖液,并持續(xù)充以95%O2和5%CO2的混合氣,建立一個測定動脈環(huán)舒張反應變化的系統。所有的動脈環(huán)用細線,懸掛于恒溫器官浴槽內,一端掛鉤連接張力傳感器,并與BL-420E+實驗系統相連,持續(xù)測定血管張力;另一端與一可移動裝置相連,進行調零、定標、穩(wěn)定、平衡、預激,以此將血管張力調節(jié)至靜止狀態(tài)下的1.5 g。將動脈環(huán)在緩沖液中平衡60min,在這個過程中每隔15 min換一次緩沖液。

1.5 實驗步驟

經60min平衡后,每5 min向緩沖槽中加入PE(10-6mol/L),Ach(10-6mol/L),檢測標本活性(收縮幅度<20%者棄去),以確保動脈收縮性能和內皮的完整。然后將動脈環(huán)沖洗2次,使其張力恢復到基線水平。

在緩沖槽中加入PE(10-6mol/L),使動脈環(huán)處于預收縮狀態(tài),此PE濃度與KCl(80mmol/L)引起的血管最大收縮力相當。當動脈環(huán)預收縮達到平臺后,通過蓄積方式加入濃度增遞的Ach,根據血管的舒張程度來評定血管的功能。預實驗發(fā)現PE為10-6mol/L時可以引起血管持續(xù)而穩(wěn)定的收縮達1 h,而10-5mol/L的PGI2抑制劑 Indo,10-6mol/L的NO抑制劑L-NAME,以及10-7mol/L和3×10-8mol/L的 EDHF抑制劑apamin和charybdotoxin,可以完全阻斷Ach引起的血管舒張反應。

實驗時在浴槽中預先加入兩條舒張途徑的抑制劑,孵育30min,濃度增遞法加入Ach(10-9～10-4mol/L),分別觀察NO、PGI2和EDHF途徑的動脈舒張功能。每次加藥前需將動脈環(huán)沖洗干凈,使血管張力恢復至基線水平。

1.6 數據分析

浴槽中先加入PE引起血管收縮,濃度增遞法加入Ach得到濃度舒張曲線,計算各濃度Ach引起的舒張百分率。舒張百分率=不同濃度Ach引起的血管舒張數值/預先使用PE引起的血管收縮數值×100%。比較的指標為Rmax(最大舒張百分率)和 EC50(產生一半最大舒張百分率時所需要Ach濃度的負對數),結果以表示。統計結果用SPSS 13.0進行分析,兩組之間采用 t檢驗。

2 結果

2.1 胸主動脈環(huán)的收縮反應

兩組動脈環(huán)對80mmol/L的 K+收縮值分別為(2.24±0.23)g和(2.56±0.57)g;對10-6mol/L的 PE收縮值分別為(2.36±0.24)g和(2.67±0.33)g,兩組比較均沒有統計學差異。

2.2 動脈環(huán)總的內皮依賴性舒張

兩組動脈環(huán)在PE作用預收縮情況下,對加入的Ach產生濃度依賴性舒張反應。相對于對照組大鼠的Rmax值81.97%±0.78%,運動組大鼠的Rmax值91.12%±0.98%顯著增高(P<0.05,表1,圖1),同時運動組對Ach的敏感性也有明顯提高(P<0.05),表明運動組胸主動脈對Ach誘導的舒張反應更明顯。

Fig.1 Relaxation effects to Ach in rings of thoracic aorta obtained from sedentary(N)or exercised(EX)rats

Tab.1 Relaxation to acetylcholine in thoracic aorta rings from sedentary and exercised rats(,n=6)

Tab.1 Relaxation to acetylcholine in thoracic aorta rings from sedentary and exercised rats(,n=6)

N:Sedentary rats;EX:Exercised rat;EC50:Sensitivity is expressed as negative log of dose inducing 50%of maximal relaxation;Rmax:Percent of maximal relaxation;NO:Nitric oxide;PGI2:Prostacyclin;EDHF:endothelium-derived hyperpolarizing factor＊P<0.05vscontrol

T otal relaxation ratio EC50(-log mol/L)Rmax(%)NO-pathway EC50(-log mol/L)Rmax(%)PGI2-pathway EC50(-log mol/L)Rmax(%)EDHF-pathway EC50(-log mol/L)Rmax(%)EX 7.78±0.21＊ 91.12±0.98＊ 7.20±0.12＊ 76.97±0.64＊ 5.71±0.19＊ 12.48±0.42＊ 3.16±0.02 6.50±0.07 N 7.26±0.13 81.97±0.78 6.15±0.10 69.75±0.57 4.82±0.07 10.06±0.26 3.02±0.01 6.25±0.05

2.3 NO途徑介導的舒張

阻斷PGI2和 EDHF途徑后測定NO介導的舒張作用,發(fā)現運動組動脈環(huán)的 Rmax為76.97%±0.64%較對照組69.75%±0.57%顯著增高(P<0.05)。運動組對Ach的敏感性也明顯提高(P<0.05),表明運動組胸主動脈經NO途徑的舒張反應更明顯,且對NO的敏感性也有所提高。

2.4 PGI2途徑介導的舒張

阻斷NO和EDHF途徑后測定PGI2途徑介導的舒張作用,發(fā)現運動組動脈環(huán)的Rmax為12.49%±0.42%較對照組10.06%±0.26%顯著增高(P<0.05)。運動組對Ach的敏感性也明顯提高(P<0.05),表明運動組胸主動脈經PGI2途徑的舒張反應更明顯,對PGI2的敏感性也有所提高。

2.5 EDHF途徑介導的舒張

阻斷PGI2和NO途徑后測定EDHF途徑介導的舒張作用,發(fā)現運動組動脈環(huán)的Rmax為6.50%±0.07%較對照組6.25%±0.05%沒有明顯變化。運動組對Ach的敏感性也沒有明顯變化,表明運動組胸主動脈對Ach誘導的經PGI2途徑的舒張反應變化不明顯。

3 討論

運動鍛煉可使得心血管產生適應性的改變[1],但其確切機制還有待于深入探討。Ach可誘導各種內皮依賴性舒張因子如NO、PGI2和EDHF的釋放,但不同部位的血管,這三個途徑的作用并不等同[2]。本實驗分別阻斷特定通路,直接測定有氧運動后大鼠動脈舒張功能的變化。實驗發(fā)現兩組大鼠動脈經NO途徑的舒張均占總舒張反應的70%以上,兩者無明顯差異,提示有氧運動對大鼠動脈舒張功能的改善作用仍以NO途徑為主,證實了他人的結果[3]。對照組大鼠動脈經PGI2途徑的舒張約占總舒張效應的12%,而運動組上升到近15%,經PGI2途徑的Rmax值也明顯提高,這表明有氧運動對內皮環(huán)氧合酶系統有一定的增強作用,與他人的結果一致[4]。實驗發(fā)現兩組大鼠EDHF介導Ach引起的內皮依賴性血管舒張中作用有限,均少于總舒張反應的10%,提示EDHF途徑在胸主動脈的內皮依賴性舒張中作用比較小,與Yen等人[5]的研究結果不同,分析原因他們的實驗對象是有動脈內皮損傷的高血壓模型大鼠。

本實驗結果表明有氧運動對大鼠胸主動脈內皮依賴性舒張功能的改善主要是由NO和PGI2兩條途徑介導的。今后需要進一步明確這種特定的內皮適應的確切機制。

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[5]Yen M H,YangJ H,SheuJ R,et al.Chronic exercise enhances endothelium-mediated dilation in spontaneously hypertensive rats[J].Life Sci,1995,57(24):2205-2213.