張笑添， 任海蘭 (山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院生物化學(xué)教研室， 汾陽 0300;山西省汾陽醫(yī)院腎內(nèi)科)

慢性HBV感染是嚴重威脅我國人民健康的疾病之一，近年來研究發(fā)現(xiàn)，機體接觸HBV后，細胞因子在宿主清除病毒的免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用，但同時也可導(dǎo)致感染肝細胞的損傷［1］。為了進一步了解慢性HBV感染的病因及發(fā)病機制，我們檢測了60例慢性HBV感染者和60例健康人群的IL-8－251A/T基因多態(tài)性，并測定其血清IL-8水平，以探討IL-8基因多態(tài)性對血清IL-8水平的影響及其與慢性HBV感染的關(guān)系。

1 對象方法

1.1 對象 選擇2009－10～2010－05山西省汾陽醫(yī)院就診的慢性HBV感染者60例，其中男32例，女28例，年齡(41.47±13.32)歲。臨床診斷均符合2005年中華醫(yī)學(xué)會肝病與感染病學(xué)分會制定的《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標準［2］。同時選擇健康人群60例作為對照組，其中男26例，女14例，年齡(41.65±13.09)歲。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準?；颊咭惨呀?jīng)知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血清IL-8水平測定 采用ELISA試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)檢測所有標本血清中IL-8的水平，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明操作。

1.2.2 IL-8基因多態(tài)性檢測 ①抽取研究對象空腹靜脈血3－5 ml，用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物技術(shù)公司)抽提DNA，－20℃凍存待檢。②使用Primer 5.0軟件設(shè)計，上游引物:5'－AATGCCTTGCTCCAACTGC－3';下游引物:5'－AAGCTTGTGTGCTCTGCTGTCTCT－3'(上海生工生物技術(shù)有限公司合成)。③PCR擴增體系為25 μl，其中模板 DNA 2 μl，上下游引物各 20 pmol，2 × Taq PCR MasterMix 12.5 μl(北京天根生物技術(shù)公司)其余用水補足。擴增條件為:95℃預(yù)變性5 min;95℃30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30 次循環(huán);最后72 ℃延伸8 min。④PCR酶切產(chǎn)物分析，取PCR擴增產(chǎn)物10 μl，限制性內(nèi)切酶MunⅠ(大連寶生物公司)10 U，0.1%BSA Buffer 2 μl，10 × M buffer 2 μl，其余用水補足，混勻后置37℃酶切過夜。⑤酶切產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V，50 min，使用凝膠成像儀觀察拍照。⑥結(jié)果判斷，IL-8－251A/T位點為AA基因型出現(xiàn)529 bp和275 bp兩條區(qū)帶，AT基因型則出現(xiàn)804 bp，529 bp和275 bp三條區(qū)帶，TT基因型出現(xiàn)804 bp一條區(qū)帶，見圖1。

圖1 IL-8－251A/T位點基因多態(tài)性的基因型分析Fig 1 Analysis of genotype of IL-8－251A/T gene polymorphism

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件包分析。按Hardy-Weiberg平衡法檢測樣本的群體代表性。組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗，不同基因型間血清IL-8水平比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-8－251A/T位點基因型頻率分布 結(jié)果顯示，IL-8－251A/T多態(tài)性位點各基因型頻率和等位基因頻率在慢性HBV感染組和對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，見表1)。

2.2 IL-8－251A/T位點不同基因型對血清IL-8水平的影響 基因型為AA型、TA型的慢性HBV感染者其血清IL-8水平顯著高于基因型為TT型的慢性HBV感染者(P＜0.01)和對照組所有基因型(P＜0.01)，見表2。

表1 兩組研究對象IL-8－251A/T基因型分布及等位基因頻率比較 例(%)Tab 1 Comparison of IL-8－251A/T genotype distribution and allele frequency between two groups cases(%)

表2 慢性HBV感染者和健康人不同基因型血清IL-8水平比較(±s，pg/ml)Tab 2 The serum IL-8 level in different genotypes of patients with chronic HBV and healthy controls(±s，pg/ml)

表2 慢性HBV感染者和健康人不同基因型血清IL-8水平比較(±s，pg/ml)Tab 2 The serum IL-8 level in different genotypes of patients with chronic HBV and healthy controls(±s，pg/ml)

與同組TT基因型及對照組所有基因型相比，*P＜0.01

IL-8基因型24 42.33 ±3.28 12 58.21 ±16.04 TA 型 23 42.32 ±2.85 26 98.47 ±30.06*AA 型 13 50.26 ±4.81 22 122.47 ±30.76 IL-8 TT型對照組n IL-8病例組n*

3 討論

機體感染HBV后，HBxAg能誘導(dǎo)IL-8的表達［3］，而使得血清中的IL-8的水平增加，并且在慢性活動性HBV感染者肝組織中IL-8的表達也高于正常組織。而細胞因子的水平與其基因多態(tài)性有關(guān)，不同的基因型有可能產(chǎn)生不同的蛋白或者改變轉(zhuǎn)錄效率，從而影響疾病的易感性及嚴重性。Hull等［4］提出IL-8基因啟動子區(qū)域某些位點的單核苷酸多態(tài)性與IL-8基因的轉(zhuǎn)錄活性及血清中IL-8的水平有關(guān)系，結(jié)果顯示－251A等位基因IL-8蛋白表達量較－251T等位基因高。同樣Taguchi等［5］和Hull等［6］也有類似的發(fā)現(xiàn)。但也有相反的結(jié)論，Lee等［7］把含A或T等位基因的IL-8啟動子克隆在pGL3質(zhì)粒上，觀察IL-8啟動子控制熒光素酶表達的強度，結(jié)果顯示含有T等位基因的熒光素酶表達強度是含A等位基因的2－5倍，從而證明－251T等位基因轉(zhuǎn)錄活性高于－251A等位基因?？梢?，不同的人種、不同的地域、不同的病例來源都會導(dǎo)致研究結(jié)果的不一致。

在本課題研究中，我們采用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)檢測慢性HBV感染者及正常對照組IL-8－251A/T基因多態(tài)性，對IL-8基因多態(tài)性進行了初步的研究。結(jié)果顯示，當IL-8－251A/T位點為A時，血清IL-8水平較高，而當IL-8－251A/T位點為T時，血清IL-8水平較低。此結(jié)果與 Taguchi等［5］和 Hull等［6］的文獻報道相一致。這一結(jié)果提示IL-8－251A/T基因多態(tài)性與血清IL-8水平存在密切關(guān)系。而較高的血清IL-8蛋白水平更能使慢性HBV感染者其肝臟炎癥細胞浸潤更加嚴重，炎性介質(zhì)釋放更多，炎癥反應(yīng)和肝細胞的損害更重，因而基因型為AA型的HBV感染者更容易發(fā)展為慢性肝炎。提示IL-8可能直接參與了病毒性肝炎患者肝臟病理損害的發(fā)生和發(fā)展，因而應(yīng)用IL-8拮抗物治療病毒性肝炎，有望為病毒性肝炎的治療另辟新徑。

而有關(guān)基因的多態(tài)性可能有更重要的生物學(xué)功能，他能夠在轉(zhuǎn)錄水平上對細胞因子的產(chǎn)生發(fā)揮作用，并影響到慢性HBV感染的易感性、疾病的嚴重程度甚至患者的預(yù)后。對基因多態(tài)性的檢測可能會成為慢性HBV感染臨床指導(dǎo)治療和分辨高危人群重要的評估指標。通過對基因的多態(tài)性的研究可能會改變我們目前的治療策略，在篩選高危人群，通過基因的調(diào)控和干預(yù)預(yù)測和治療慢性HBV感染等方面有良好的前景。

但本次研究IL-8基因多態(tài)性的分析時僅在小樣本中作了初步嘗試，還需要進一步在更大的獨立患者樣本及家系中進行群體遺傳學(xué)研究，謹慎的重復(fù)性試驗來進一步研究IL-8基因多態(tài)性與慢性HBV感染結(jié)局的相關(guān)性。

［1］ Wang FS.Current status and prospects of studies on human genetic alleles associated with hepatitis B virus infection［J］.World J Gastroenterol，2003，9(4):641 － 644.

［2］ 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會、感染病學(xué)分會.慢性乙型肝炎防治指南［J］.中華肝臟病雜，2005，12(3):881 －891.

［3］ Tilg H，Kaser A，Moschen AR.How to modulate inflammatory cytokines in liver diseases［J］.Liver Int，2006，26(9):1029 －1039.

［4］ Hull J，Thomson A，Kwiatkowski D，et al.Association of respiratory syncytial virus bronchiolitis with the interleukin-8 gene region in UK families［J］.Thorax，2000，55(12):1023 － 1027.

［5］ Taguchi A，Ohmiya N，Shirai K，et al.Interleukin-8 promoter polymorphism increases the risk of atrophic gastritis and gastric cancer in Japan［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2005，14:2487 －2493.

［6］ Hull J，AckermanH，Isles K，et al.Unusual haplotypic structure of IL8，a susceptibility locus for a common respiratory virus［J］.Am J Hum Genet，2001，69:413 － 419.

［7］ Lee WP，Tai DI，Lan KH，et al.The-251T allele of the interleukin-8 promoter is associated with increased risk of gastric carcinoma featuring diffuse-type histopathology in Chinese population［J］.Clin Cancer Res，2005，11:6431 －6441.