孔繁德 劉陽， 徐淑菲 彭小莉 吳德峰 林 立

免疫金層析技術(shù)快速檢測副溶血弧菌方法的初步研究*

孔繁德1劉陽1，2徐淑菲1彭小莉1吳德峰2林 立1

1.廈門出入境檢驗檢疫局；2.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院

本研究應(yīng)用兔抗IgG-2包被硝酸纖維素膜檢測線，羊抗兔IgG包被對照線，膠體金標(biāo)記兔抗IgG-1，建立了檢測副溶血弧菌（）的免疫金層析試紙條法（IGCA）。結(jié)果表明，陽性者試紙條檢測線和對照線均出現(xiàn)紅色線，實驗過程僅需5～15min即可判斷結(jié)果，該法對的最低檢測量為3.60×104cfu/mL，與溶藻弧菌、霍亂弧菌、美人魚弧菌、麥?zhǔn)匣【?、弗氏枸櫞酸桿菌和沙門菌等常見腸道菌不發(fā)生交叉反應(yīng)。將試紙條4℃存放6個月、常溫存放3個月，37℃存放1個月，檢測結(jié)果無差異。說明建立的試紙條檢測方法操作簡便快速、靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好，結(jié)果容易觀察和判斷，非常適于基層養(yǎng)殖部門應(yīng)用。

副溶血弧菌 膠體金 免疫層析

副溶血弧菌(，簡稱)最早是由Fujino等[1]于1953年從日本一個食物中毒患者身上初次分離得到的，是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，常呈多態(tài)性，有鞭毛，無莢膜和芽孢。在含3%～5%的食鹽培養(yǎng)基中，pH7.5-8.5及37℃條件下，生長最為良好并且對酸敏感。該菌分布于世界各地，通常廣泛分布于近海區(qū)域、鹽湖及魚、貝類等海產(chǎn)品中，是沿海地區(qū)引起食物中毒的重要病原菌，在食物中的數(shù)量超過106即可導(dǎo)致患者出現(xiàn)腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐和頭疼等典型胃腸炎反應(yīng)，嚴(yán)重者可引起敗血癥甚至死亡，也曾有發(fā)燒和發(fā)冷的報道，但較少。我國沿海地區(qū)每年都有因副溶血性弧菌引起食物中毒的報道。1998年以來的資料顯示，副溶血弧菌引發(fā)食物中毒的規(guī)模呈明顯的上升趨勢，已超過沙門菌食物中毒，躍居首位[2]。為有效控制副溶血弧菌病原的發(fā)生擴散，準(zhǔn)確即時的檢測手段正是預(yù)防控制、傳播的關(guān)鍵所在。

目前，V.parahaemolyticus的檢測技術(shù)主要有傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附 (ELISA )法[3]和免疫熒光抗體技術(shù)[4]，也有現(xiàn)代的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，如環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)[5]、PCR技術(shù)[6-10]、熒光定量PCR技術(shù)[11-12]、UPPCR-SSCP技術(shù)[13]、變性高效液相色譜（DHPLC）技術(shù)[14]和Transcription- reverse transcription concerted(TRC)方法[15]、DNA指紋圖譜技術(shù)[16]等。但綜合來看，以上介紹的各種方法各有其優(yōu)缺點，在快速檢測、定性和精確定量方面難以兼顧。傳統(tǒng)方法費時費力，對于需要檢測大量樣本的出入境檢疫、食品、衛(wèi)生以及獸醫(yī)部門的實驗室是一種沉重的負擔(dān)，不僅影響檢驗機構(gòu)的工作效率，而且使生產(chǎn)部門的產(chǎn)品運輸和倉儲時間延長，生產(chǎn)成本加大。因此，快速檢測方法方面的研究越來越受到關(guān)注。

目前快速檢測研究主要集中在膠體金試紙條、斑點金滲濾法、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗、PCR和熒光PCR等方法上，其中免疫熒光技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗需要一定的操作經(jīng)驗和儀器設(shè)備，而分子生物學(xué)檢測技術(shù)，如PCR和熒光PCR，則更需要專業(yè)技術(shù)和檢測經(jīng)驗以及較昂貴的檢測設(shè)備，難以在口岸一線部門和基層養(yǎng)殖部門推廣使用。免疫膠體金技術(shù)是20世紀(jì)90年代以來繼三大標(biāo)記技術(shù)（熒光素、放射性同位素和酶）后發(fā)展起來的一項新型體外固相標(biāo)記免疫診斷技術(shù)，具有操作簡單、快速、靈敏、可現(xiàn)場操作等優(yōu)點[17-18]，適應(yīng)于口岸快速檢測的需要。本研究旨在以為試驗材料，制備兔抗副溶血弧菌多克隆抗體，利用先進的膠體金生產(chǎn)工藝來研制檢測的金標(biāo)檢測試紙條。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器主要有高速冷凍離心機(Backman)、硝酸纖維素膜（美國Millipore公司）、玻璃纖維膜（上海金標(biāo)生物科技公司）、吸水紙、透析袋等；試劑均為分析純，氯金酸（上海市試劑總廠化學(xué)試劑一廠產(chǎn)品）、檸檬酸三鈉、酪蛋白、牛血清白蛋白、羊抗兔IgG、碳酸鉀等，膠體金稀釋液（含1％BSA，0.05％PEG20000，5％蔗糖，0.05%Tween-20的0.01mol/L pH7.2的PBS緩沖液）。

1.2 菌株

副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、麥?zhǔn)匣【⑸抽T菌、枸櫞酸桿菌各1株，均由廈門出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心動檢實驗室提供。

1.3 兔抗副溶血弧菌多克隆抗體的制備與純化

參照文獻[19]中的方法稍作改進，將純化好的副溶血弧菌接種3.5%堿性蛋白胨水，37℃培養(yǎng)18～24h后，用終濃度為0.3%的甲醛滅活24 h后取少量滅活菌液接種3.5%堿性蛋白胨水37℃培養(yǎng)24h后，檢測滅活是否徹底。將滅活后的菌體用滅菌生理鹽水洗滌三遍，然后再用含雙抗的滅菌生理鹽水稀釋到原體積的1/10，將此滅活的菌液混勻后用于免疫家兔，采用背部皮下多點注射和靜脈直接注射兩種免疫方式，其中皮下多點注射為將菌液用弗氏完全佐劑等體積混勻后背部皮下多點注射4mL，2周后菌液用弗氏不完全佐劑等體積混勻后再次背部皮下多點注射4mL，2周后采血前5～7天靜脈注射4mL，當(dāng)凝集效價達到1:1280或1:2560時采血，所得抗體為兔抗IgG-1（簡稱兔抗-1）；靜脈直接注射法，每10 d注射一次，首次注射1mL，第二、三、四次劑量依次為1.5、2、3mL，當(dāng)凝集效價達到1:1280或1:2560時采血，所得抗體為兔抗IgG-2（簡稱兔抗-2）。將采集的血液放4℃過夜，次日3000 r/min離心10 min，分離血清，采用飽和硫酸銨沉淀法純化[20]，然后用溶藻弧菌、霍亂弧菌、麥?zhǔn)匣【?、沙門菌、枸櫞酸桿菌等菌體常溫振蕩吸附2～3 h，SDS-PAGE鑒定純度[21]，直接血凝試驗測定效價[22]。

1.4 膠體金的制備和金標(biāo)多抗的制備

參照文獻[23]的檸檬酸鈉還原法并稍作改進，準(zhǔn)確量取99 mL經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾的去離子雙蒸水加入到處理干凈的三角錐形瓶中，再取1mL 1%氯金酸加入錐形瓶中，所得氯金酸溶液濃度為0.01%，置于磁力攪拌鍋中加熱至沸騰，在磁力攪拌器攪拌下快速加入2 mL的1%檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)攪拌加熱煮沸，待溶液變?yōu)槠咸丫萍t色后再繼續(xù)加熱煮沸5～8 min。經(jīng)紫外分光光度計測其吸收峰在520nm處，得到的膠體金顆粒直徑約為20nm左右，冷卻后置于4℃冰箱中避光保存。

將制備好的膠體金用0.1mol/L K2CO3調(diào)節(jié)pH至8.5[24]，取制備量的膠體金溶液，在磁力攪拌下逐滴加入純化的兔抗-1（按每毫升膠體金溶液加入16.7μg純化的兔抗-1），繼續(xù)磁力攪拌30 min后加入經(jīng)0.22 μm濾膜過濾的5%PEG（MW6000）至終濃度為0.1%，繼續(xù)磁力攪拌15min，最后放置4℃冰箱，靜置過夜。次日將標(biāo)記好的膠體金于4000 r/min離心10 min，取上清于15000 r/min離心30 min，小心吸棄上清，沉淀用膠體金稀釋液恢復(fù)到原體積的1/20，置4℃冰箱備用。

1.5 金標(biāo)快速檢測試紙條的組裝

把金標(biāo)兔抗-1處理過的樣品墊（玻璃纖維膜）、吸水紙、檢測線（T線）（包被兔抗-2）和對照線（C線）（包被羊抗兔IgG）已包被好的硝酸纖維素膜（NC膜）按順序貼到不干膠底板上，切割成條，分裝到裝有干燥劑的鋁箔袋中密封。

1.6 膠體金免疫層析試紙條法（IGCA）最佳條件的確定[17-18]

1.6.1 最佳封閉液的選擇

將T、C線已包被好相應(yīng)成分的NC膜用不同配方的封閉液封閉，烘干后組裝成試紙條進行IGCA實驗，并將試驗結(jié)果進行對比，選擇條帶顏色清晰且背景較淺的一組封閉液配方作為最適封閉液。

1.6.2 各成分最佳濃度和靈敏度的測定

分別把金標(biāo)兔抗-1、兔抗-2和羊抗兔IgG按一定的比例進行稀釋，組合成方陣，包被在玻璃纖維膜、檢測線（T線）和對照線（C線）上，制成不同濃度的試紙條組合，然后用10倍梯度稀釋的副溶血弧菌懸液進行檢測，以得出最佳組合。

1.6.3 特異性試驗

用上述條件優(yōu)化后制備組裝的試紙條，檢測副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、美人魚弧菌、弗氏枸櫞酸桿菌和沙門氏菌，觀察結(jié)果。

1.6.4 穩(wěn)定性試驗

將在同一時間按優(yōu)化后的條件制備的試紙條平均分成三批，分裝到裝有干燥劑的鋁箔袋中密封，然后分別置4℃冰箱、室溫和37℃培養(yǎng)箱中保存，冰箱的每隔1個月取出2條，室溫和培養(yǎng)箱的每隔1周取出2條，進行副溶血弧菌陽性檢測，測試時間9個月，觀察T、C線。

1.6.5 臨床試驗

進口冷凍帶魚、魷魚和墨魚，活甲魚、甲魚蛋、螃蟹和蝦等100份樣品，用試紙條法檢測，同時與傳統(tǒng)檢測方法進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳封閉液的選擇

T、C線包被好的NC膜分別用以下8種封閉液進行封閉：(1)1%BSA、0.5%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(2)0.5%BSA、0.5%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(3)1%BSA、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(4)0.5%BSA、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(7)1%casein、0.5%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS。(8)0.5% casein、0.5%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(9)1% casein、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(10)0.5% casein、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS。結(jié)果顯示，用含1% casein、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS封閉效果最好，斑點顯色清楚，背景較淺。如圖1所示。

1-4，7-10分別為（1）-（4），（7）-（10）號封閉液

2.2 試紙條的最佳條件和靈敏度的確定

通過T線包被兔抗-2的抗體濃度為0、24.32、48.64、72.96、97.28、121.6、145.92、170.24mg/mL的8個濃度梯度，金標(biāo)兔抗-1的體積為標(biāo)記前膠體金體積的1/5、1/10、1/15、和1/20時，組合組裝成方陣試紙條，然后用10倍系列稀釋的副溶血弧菌菌懸液進行檢測。結(jié)果當(dāng)T線兔抗-2濃度為121.6mg/mL以上，金標(biāo)兔抗-1的體積為標(biāo)記前膠體金體積的1/15時，菌液濃度最低為3.592×106cfu/mL時檢測線顯色較清楚，并且靈敏度可達到3.592×104cfu/mL(見圖2)。

對照線包被羊抗兔IgG，濃度為0、2、4、6、8、10 mg/mL的6個濃度梯度，再用前面確定的兔抗-2和金標(biāo)兔抗-1的最佳濃度進行反應(yīng)，最后得出C線包被羊抗兔IgG的最低濃度為6mg/mL（見圖3）。

因此最終確定試紙條T線兔抗-2的濃度為121.6mg/mL，C線包被羊抗兔IgG的濃度為6mg/mL，金標(biāo)兔抗-1稀釋為標(biāo)記前體積的1/15時顯示最佳檢測效果，并且靈敏度可達到3.592×104cfu/mL。

1-6：V.parahaemolyticus的菌液濃度依次為3.592×108，3.592×107，3.592×106，3.592×105，3.592×104，3.592×103 cfu/mL

0、2、4、6、8、10依次為C線劃線濃度0、2、4、6、8、10 mg/mL

2.3 試紙條的特異性

檢測副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、美人魚弧菌、麥?zhǔn)匣【?、弗氏枸櫞酸桿菌、沙門菌7株菌株，只有的C、T線，均出現(xiàn)紫紅色線，顯示陽性結(jié)果；而其余6株菌株只有C線出現(xiàn)紫紅色線，T線沒有出現(xiàn)紫紅色線，顯示陰性結(jié)果，如圖4所示。

1-7依次為沙門氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌、麥?zhǔn)匣【?、美人魚弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌

2.4 試紙條的穩(wěn)定性

測試期間，4℃密封放置6個月、室溫密封放置3個月、37℃溫箱密封放置1個月檢測結(jié)果沒有異常變化，監(jiān)測試紙條放置4℃保存比較穩(wěn)定。

2.5 臨床試驗

用試紙條法檢測進口冷凍帶魚、魷魚和墨魚，活甲魚、甲魚蛋、螃蟹和蝦等100份樣品，結(jié)果從進口甲魚中檢出2份副溶血弧菌陽性和3份溶藻弧菌陽性，從進口螃蟹中檢出1份副溶血弧菌陽性和2份溶藻弧菌陽性，檢測結(jié)果與常規(guī)細菌分離鑒定結(jié)果完全吻合，但檢測時間從常規(guī)檢測時間至少4d縮短為2d內(nèi)，大大加快了檢測進程。

3 討論

副溶血弧菌是一種廣泛分布于海洋與鹽湖的嗜鹽性細菌，能引起蝦、蟹及海產(chǎn)貝類患病。該菌也是引起人類食源性疾病的主要病原之一，是我國沿海地區(qū)食物中毒和夏季腹瀉的重要病，嚴(yán)重威脅人們的身體健康并造成經(jīng)濟財產(chǎn)的巨大損失[3]。1998年以來的數(shù)據(jù)顯示，副溶血弧菌性食物中毒的發(fā)生規(guī)模及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢，已超過沙門氏菌食物，躍居細菌性中毒的首位。

為有效控制病原的發(fā)生擴散，有一個準(zhǔn)確即時的檢測手段正是預(yù)防控制VP傳播的關(guān)鍵所在。近十幾年，對副溶血弧菌的檢測方法已從常規(guī)的培養(yǎng)檢測發(fā)展到以免疫學(xué)或DNA為基礎(chǔ)的快速檢測。前者分離培養(yǎng)病原菌需要時間較長，而許多傳染病在2~3d內(nèi)就能造成很大的損失；免疫PCR技術(shù)和PCR-ELISA 技術(shù)雖然具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好，以及不受病原發(fā)育時期的限制和不受環(huán)境影響的優(yōu)點，但因使用的儀器精密、藥品昂貴，同時檢測程序復(fù)雜，要得到普及和廣泛使用尚有一定難度；酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)(ELISA)，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和可重復(fù)性強等特點，并且易制成檢測特定種類病原菌的商品性試劑盒，更適合于野外操作及大量樣品的檢測，在病原性弧菌檢測中有著突出的優(yōu)點，但該方法檢測所用的聚苯乙烯酶標(biāo)板是一種良好的固相載體，對蛋白質(zhì)有較強的物理吸附能力，但對顆粒性抗原如細菌等的吸附較差，直接將其包被在酶標(biāo)板上較為困難[3]。

膠體金技術(shù)是目前比較常見的標(biāo)記技術(shù)，自1971年Faulk和Taylon[25]用兔抗沙門氏菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合制成金標(biāo)抗體檢測沙門氏菌表面抗原的分布，40多年來膠體金標(biāo)記技術(shù)得到不斷的發(fā)展和成熟，這期間該技術(shù)發(fā)展到透射電鏡、掃描電鏡等各領(lǐng)域。它是繼三大免疫標(biāo)記技術(shù)之后又一較為成熟地得到廣泛應(yīng)用的免疫標(biāo)記技術(shù)。

目前副溶血弧菌的檢測方法很多，但是大多操作較復(fù)雜、檢測時間較長、需要特異的引物、昂貴的試驗儀器和專業(yè)的實驗人員等因素導(dǎo)致這些方法不能適應(yīng)現(xiàn)場的快速檢測要求。本研究利用膠體金為示蹤物，采用副溶血弧菌的兔多克隆抗體運用雙抗夾心法成功研制了副溶血弧菌免疫層析試紙條。本試紙條法檢測副溶血弧菌的靈敏度可達3.592×104cfu/mL，與已知亞型副溶血弧菌呈強陽性反應(yīng)，而與其它細菌無交叉反應(yīng)。試紙條在4℃和室溫存放數(shù)月，檢測結(jié)果沒有顯著變化，說明其具有較好的穩(wěn)定性。對臨床采集樣品陽性檢出率高。由此可見，本研究研制的試紙條具有特異性強、敏感度高、穩(wěn)定性好、操作簡單、可現(xiàn)場操作、無需任何儀器和專業(yè)人員、可憑肉眼在30min內(nèi)判定結(jié)果等優(yōu)點，如果將此方法進行改良制備成商品試劑盒，不僅較其它方法快速準(zhǔn)確，而且可大幅度降低檢驗成本，減少勞動強度，省時省料，更適合于野外操作及大批量、大范圍的樣品檢測，有望實現(xiàn)對副溶血弧菌病的快速、準(zhǔn)確診斷，特別適合于在基層單位推廣使用，具有良好的應(yīng)用前景。

綜上所述，本研究建立的副溶血弧菌免疫金試紙條檢測方法，與傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法和生化鑒定相比，具有特異性強、靈敏度高，方便快捷、成本低等特點，為副溶血弧菌的檢測提供了新的發(fā)展方向，有望成為簡易的常規(guī)檢測手段，尤其適用于基層檢驗檢疫機構(gòu)，對于海產(chǎn)品中副溶血弧菌的監(jiān)控檢測和養(yǎng)殖業(yè)健康持續(xù)發(fā)展，提高食品衛(wèi)生水平，保證食品安全和推動食品國際貿(mào)易發(fā)展具有重要的意義。

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國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局科技計劃項目（2010IK016）。