鄭 毅 王 婭 朱志春 邱婷玉 陳 燕

發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q10研究進(jìn)展*

鄭 毅 王 婭 朱志春 邱婷玉 陳 燕

福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

輔酶Q10是一種重要的生化藥物，主要生產(chǎn)方法有直接提取法、化學(xué)合成法與微生物發(fā)酵法，其中，微生物發(fā)酵法是最有前途的生產(chǎn)方法。該文綜述了微生物發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10的研究進(jìn)展，內(nèi)容包括輔酶Q10的生產(chǎn)菌種、高產(chǎn)菌株的選育手段、發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件對(duì)輔酶Q10發(fā)酵的影響。

輔酶Q10微生物發(fā)酵法 研究進(jìn)展

1 概述

輔酶Q10是一種脂溶性的醌類化合物，化學(xué)名稱為2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基-1，4-二苯醌，別名癸烯醌、泛醌，分子式為C59H90O4，分子量為863.36，在室溫下呈橙黃色結(jié)晶，無(wú)臭無(wú)味。輔酶Q10的生理功能與其兩種生化作用密切相關(guān)：一是其具有的抗氧化能力，二是其在電子傳遞鏈上的角色，傳遞電子與質(zhì)子，促進(jìn)生成ATP。輔酶Q10還原態(tài)的、異戊二烯單體全為反式的結(jié)構(gòu)比氧化態(tài)、異戊二烯單體全為順式結(jié)構(gòu)具有更高的活性和理化作用。目前輔酶Q10在醫(yī)學(xué)上是一種很好的臨床生化藥物，常用于肝病、心血管疾病、癌癥的綜合治療與提高機(jī)體的免疫力。在食品領(lǐng)域作為一種新型食品營(yíng)養(yǎng)添加劑，具有增強(qiáng)體能與提高免疫力的作用。同時(shí)輔酶Q10對(duì)延緩衰老和提高機(jī)體免疫力有著不可代替的作用，被廣泛應(yīng)用于女性化妝品領(lǐng)域[1]。

2 輔酶Q10的生產(chǎn)方法

輔酶Q10的生產(chǎn)方法一般分為直接提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法等[2]。直接提取法主要從大豆、煙葉或動(dòng)物內(nèi)臟中進(jìn)行分離和提取。提取法制備工藝較簡(jiǎn)單，但提取成本高，且受原料及季節(jié)等的限制，不適合于現(xiàn)代化工業(yè)大生產(chǎn)。化學(xué)合成法主要分為不以茄尼醇作為原料的全化學(xué)合成法、以茄尼醇作為原料的半化學(xué)合成法。化學(xué)合成法合成過(guò)程反應(yīng)復(fù)雜、步驟多、轉(zhuǎn)化效率低、往往還存在許多副產(chǎn)物，這些因素都影響了其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。微生物發(fā)酵法是目前生產(chǎn)輔酶Q10的最主要方法。該方法由于原料廉價(jià)豐富，產(chǎn)物分離過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，產(chǎn)物為天然品，不存在化合物手性問(wèn)題，生物活性好，易被人體吸收，且可以通過(guò)發(fā)酵罐實(shí)現(xiàn)規(guī)?；I(yè)化生產(chǎn)，因此成為最有發(fā)展?jié)摿Φ妮o酶Q10生產(chǎn)方法。

3 輔酶Q10主要產(chǎn)生菌及高產(chǎn)菌株選育

輔酶Q10產(chǎn)生菌大多為細(xì)菌[3]，主要包括莢膜紅細(xì)菌、類球紅細(xì)菌、渾球紅細(xì)菌、沼澤紅假單胞菌、深紅紅螺菌和根癌農(nóng)桿菌等。通常微生物發(fā)酵產(chǎn)生輔酶Q10的產(chǎn)量在30～130mg/L，據(jù)估計(jì)要實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)，輔酶Q10的產(chǎn)量應(yīng)該高于500mg/L[4]。在國(guó)際上，日本是最早開(kāi)發(fā)輔酶Ｑ10的國(guó)家，報(bào)道的球紅假單胞菌菌種生產(chǎn)水平達(dá)到770mg/L，收率達(dá)到70%以上，近幾年來(lái)，韓國(guó)在輔酶Ｑ10領(lǐng)域的研究也較為深入，其中根癌農(nóng)桿菌KCCM10413的發(fā)酵水平達(dá)到626mg/L。國(guó)內(nèi)上世紀(jì)90年代開(kāi)始發(fā)酵法輔酶Q10的研究，表1列出國(guó)內(nèi)研究單位輔酶Q10主要菌種，目前我國(guó)多家企業(yè)參與開(kāi)發(fā)和發(fā)酵生產(chǎn)，其中廈門(mén)金達(dá)威集團(tuán)、神舟生物已經(jīng)投入工業(yè)化生產(chǎn)，所生產(chǎn)的輔酶Q10產(chǎn)品已經(jīng)占據(jù)市場(chǎng)相當(dāng)大的份額。

輔酶Q10高產(chǎn)菌株主要選育方法是采用傳統(tǒng)誘變選育輔酶Q10高產(chǎn)菌株，即將輔酶Q10的出發(fā)菌株經(jīng)過(guò)一些誘變因子處理，如紫外誘變和NTG誘變，然后選育出營(yíng)養(yǎng)缺陷型、抗反饋調(diào)節(jié)、抗葡萄糖分解阻遏的輔酶Q10高產(chǎn)菌株，表2列出國(guó)內(nèi)成功選育的典例。近年也有采用基因工程育種與基因改組育種選育輔酶Q10高產(chǎn)菌株的相關(guān)報(bào)道[5-10]。

表1 國(guó)內(nèi)開(kāi)發(fā)輔酶Q10主要菌種

4 發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)輔酶Q10發(fā)酵的影響

4.1 碳、氮源對(duì)輔酶Q10發(fā)酵的影響

碳、氮源是微生物生長(zhǎng)所需的重要營(yíng)養(yǎng)因子，其中碳源是構(gòu)成微生物細(xì)胞的骨架，為各種代謝提供能量；氮源提供微生物其它細(xì)胞結(jié)構(gòu)的原材料。不同種類的蛋白質(zhì)，其氨基酸的種類和含量具有一定的差異，培養(yǎng)基中部分氨基酸的濃度對(duì)其產(chǎn)物具有很大的影響，不同的微生物對(duì)碳、氮源的需求也不一樣。吳祖芳等考察了玉米漿、蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、糖蜜、蔗糖等幾種碳氮源和添加物以及流加發(fā)酵生長(zhǎng)因子對(duì)放射型根瘤菌WSH2601（WSH2601）的細(xì)胞生長(zhǎng)和輔酶Q10合成的影響[5]，實(shí)驗(yàn)證明，最佳碳源為蔗糖，其次為糖蜜和葡萄糖；最佳氮源為玉米漿，其次為酵母膏，蛋白胨較差些。魏寶東等考察蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉對(duì)合成輔酶Q10的影響，結(jié)果表明最佳碳源為蔗糖，輔酶Q10產(chǎn)量為40.54mg/L，其次是葡萄糖。

4.2 生長(zhǎng)因子和無(wú)機(jī)鹽對(duì)輔酶Q10發(fā)酵的影響

不同的生長(zhǎng)因子對(duì)產(chǎn)物形成的影響具有一定的差異，如氨基酸、核酸堿基、維生素和天然氮化物在不同菌種中影響大小不同。潘春梅等[9]研究了幾種促進(jìn)劑對(duì)放射型根瘤菌細(xì)胞生長(zhǎng)及其輔酶Q10發(fā)酵的影響，結(jié)果表明：VB1對(duì)輔酶Q10的合成起明顯促進(jìn)作用，當(dāng)VB1添加量為10mg/L，乙酸鈉2g/L，花生油2g/L時(shí)，輔酶Q10產(chǎn)量達(dá)到50.7mg/L，比對(duì)照組分別提高33%。

一些金屬離子也能提高輔酶Q10的產(chǎn)量，袁靜等[10]研究表明適當(dāng)濃度的Co2+、Fe2+、Mg2+等對(duì)輔酶Q10的合成具有一定的促進(jìn)作用，Mg2+是輔酶Q10合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶的輔基，F(xiàn)e2+起著電子傳遞的作用[10]。

5 發(fā)酵條件對(duì)輔酶Q10發(fā)酵的影響

5.1 溶氧對(duì)輔酶Q10發(fā)酵的影響

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，通氣量是輔酶Q10發(fā)酵的一個(gè)重要影響因素，大多數(shù)的輔酶Q10發(fā)酵都為有氧發(fā)酵。對(duì)于某些菌體而言，較高的溶氧有利于輔酶Q10的合成，有些菌種低氧有利于輔酶Q10的合成。Hajime Yoshidat研究表明，低通氣量時(shí)可以促進(jìn)和輔酶Q10的合成，高通氣量抑制了輔酶Q10的合成[11]。吳祖芳等[8]研究表明，發(fā)酵的不同時(shí)期溶氧對(duì)輔酶Q10的合成具有不同的影響，前期菌體的快速生長(zhǎng)，溶氧應(yīng)高些，在細(xì)胞穩(wěn)定期后，應(yīng)控制為低氧，有利于輔酶Q10的合成。

5.2 pH對(duì)輔酶Q10發(fā)酵的影響

pH是微生物發(fā)酵代謝活動(dòng)中一個(gè)重要的綜合指標(biāo)，是發(fā)酵中一個(gè)重要的參考參數(shù)。pH對(duì)菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累有很大的影響。在生產(chǎn)中通過(guò)檢測(cè)和控制適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)pH，可以促進(jìn)菌體合成輔酶Q10。在實(shí)際生產(chǎn)發(fā)酵中調(diào)節(jié)pH具有以下幾個(gè)手段：（1）用碳酸鈣作為緩沖劑；（2）用氨水來(lái)調(diào)節(jié)pH；（3）控制補(bǔ)糖的速率。許激揚(yáng)等[12]研究表明，酵母菌SY-3在pH=4時(shí)輔酶Q10較高。葉博等[13]研究表明黃色隱球酵母菌在pH=6.5時(shí)輔酶Q10產(chǎn)量最大。

5.3 發(fā)酵溫度對(duì)輔酶Q10發(fā)酵的影響

溫度對(duì)輔酶Q10的積累具有一定的影響，主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：（1）溫度既影響菌體的生長(zhǎng)，同時(shí)也對(duì)輔酶Q10的生物合成具有影響，比如影響代謝途徑的方向。（2）溫度影響發(fā)酵液的粘稠度，影響溶解氧的傳遞和基質(zhì)的溶解。陳亮等[14]研究表明，粉紅擲孢酵母最適合菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵溫度為28～32℃，當(dāng)溫度在30℃時(shí)，輔酶Q10含量達(dá)到最高。姜?jiǎng)ξ牡萚15]研究表明，根癌農(nóng)桿菌最適發(fā)酵溫度為32℃。

6 展望

隨著輔酶Q10的需求量不斷攀升，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q10顯得愈發(fā)重要。為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，一方面要加快高產(chǎn)菌株的選育進(jìn)程，采用分子生物學(xué)技術(shù)的新型育種手段，應(yīng)用代謝工程的方法選育高產(chǎn)菌株，構(gòu)建工程菌株。另一方面，要進(jìn)一步深入研究輔酶Q10發(fā)酵過(guò)程生化研究，優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程各個(gè)參數(shù)的工藝控制，同時(shí)建立自動(dòng)化控制模式，從而實(shí)現(xiàn)工程菌的高效表達(dá)。

[1] 韓少英, 竇潔, 周長(zhǎng)林. 發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q10的研究進(jìn)展[J]. 藥物生物技術(shù), 2006, (03):227-232.

[2] Kawamukai M. Biosynthesis and bioproduction of coenzyme Q10by yeasts and other organisms[J]. Biotechnology and applied biochemistry. 2009, 53(4):217-226.

[3] Yoshida H, Kotani Y, Ochiai K, et al. Production of ubiquinone-10 using bacteria[J]. The Journal of general and applied microbiology, 1998, 44(1):19-26.

[4] Cluis CP, Burja AM, Martin VJJ. Current prospects for the production of coenzyme Q10in microbes[J]. Trends in biotechnology, 2007, 25(11): 514-521.

[5] 吳祖芳, 翁佩芳, 李寅等. 輔酶Q10發(fā)酵生產(chǎn)的育種思路及發(fā)酵條件優(yōu)化策略[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2001 (7):49-53.

[6] 劉克杉, 吳文芳, 韓斯琴等. 輔酶Q10高產(chǎn)菌株的選育[J]. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005 (1):89-92.

[7] 張向陽(yáng), 劉登如, 堵國(guó)成等. 輔酶 Q10產(chǎn)生菌的抗性篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 工業(yè)微生物, 2007, 37(3):5-9.

[8] 吳祖芳, 堵國(guó)成, 陳堅(jiān). 放射型根瘤菌WSH2601生產(chǎn)輔酶Q10的搖瓶發(fā)酵條件[J]. 無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào), 2003 (1):65-69.

[9] 潘春梅, 邊傳周, 張曉靜等. 促進(jìn)劑對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10的影響[J]. 工業(yè)微生物, 2007 (1):30-33.

[10] 袁靜, 魏泓. 光合細(xì)菌產(chǎn)輔酶Q10發(fā)酵條件的研究[J]. 氨基酸和生物資源, 2003(2):24-27.

[11] Wu Z, Du G, Chen J. Effects of dissolved oxygen concentration and DO-stat feeding strategy on CoQ10production with Rhizobium radiobacter[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2003, 19(9):925-928.

[12] 許激揚(yáng), 岳小飛, 肖海蓉. 輔酶Q10高產(chǎn)酵母菌SY-3發(fā)酵工藝的研究[J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2006 (S1):610-612.

[13] 葉博, 劉玲, 李革. 黃色隱球酵母生產(chǎn)輔酶Q10發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 微生物學(xué)雜志, 2005(4):60-63.

[14] 陳亮, 朱振華, 陳五嶺等. 輔酶Q10的高產(chǎn)菌種篩選及發(fā)酵工藝優(yōu)化[J]. 西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2007(3):429-432.

[15] 姜?jiǎng)ξ? 陳光, 王立梅等. 根癌農(nóng)桿菌發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10的培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(12):6128-6130.

* 福建省教育廳資助項(xiàng)目，編號(hào)JA10067。