郭麗，祁榮，吳鵬

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110034)

目前，免疫組化染色技術(shù)已成為病理學(xué)診斷的重要手段。幾年來(lái)抗原修復(fù)廣泛應(yīng)用于免疫組化檢測(cè)，抗原修復(fù)使抗原決定簇充分暴露是免疫組化染色成功的關(guān)鍵。在熱修復(fù)法中，壓力鍋加熱法又較微波爐加熱法更有效，酶消化法修復(fù)的抗原免疫組化的染色效果不如熱修復(fù)法[1]。有少數(shù)抗原酶消化后染色的結(jié)果優(yōu)于熱修復(fù)法[2]。電爐煮沸抗原修復(fù)法也被許多人所采用。為了選擇適宜的抗原修復(fù)法，我們先后采用壓力鍋抗原修復(fù)、電爐煮沸抗原修復(fù)、復(fù)合酶抗原修復(fù)法，對(duì)五種抗體的免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行篩選，選擇最適宜的抗原修復(fù)法，以獲得最佳的免疫組化的陽(yáng)性結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與染毒 Wistar大鼠120只(沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)體質(zhì)量230～250 g，按雌∶雄為2∶1于每晚6時(shí)合籠，次晨7～9時(shí)陰道涂片檢查精子，查到精子定為妊娠0 d。實(shí)驗(yàn)組從妊娠6 d開(kāi)始染毒，將NaAsO2溶于蒸餾水中，孕鼠自由飲用，飲水中的砷染毒劑量分別為10、50、100 mg/L，仔鼠出生后，母鼠繼續(xù)飲含砷水，在仔鼠生后的0、28、42 d分批斷頭處死仔鼠，取大腦，用10%甲醛溶液固定[3]。

1.2 方法 染毒(蒸餾水配制的NaAsO2自由飲水染毒)劑量為10、50、100 mg/L，為實(shí)驗(yàn)組。陰性(自由飲用蒸餾水)對(duì)照組。胎鼠出生后，第0天、第28天、第40天分別處死，取大腦，用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，組織切片5 μm，暴露大腦皮質(zhì)及海馬。選用鼠抗人單克隆抗體，NMDAR2A、NMDAR2B、NMDAR1、CHAT、ACTH及即用型SABC免疫組化試劑盒，均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。依抗原修復(fù)法分3組，5個(gè)抗體，每個(gè)抗體16例，每例兩張切片，即32張/抗體。酶修復(fù)法只作了兩個(gè)抗體。 玻片清潔處理，流水沖洗，酒精浸片，100 ℃烤片，冷卻，涂上多聚賴氨酸(1∶10)晾干備用。切片脫蠟水化至PBS備用。切片滴加3% H2O2，室溫，10 min，以滅活過(guò)氧化物酶?？乖迯?fù)：(1)高壓加熱法：在高壓鍋內(nèi)放置裝有約500 ml，10 mM/L的枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)的法蘭缸(或燒杯)，預(yù)熱至壓力鍋內(nèi)水沸騰，將裝有切片的金屬染色提籃放入緩沖液中(切片組織浸入緩沖液中)，切片之間留出一定的距離，最后一張切片組織應(yīng)背向金屬架[4]，然后高壓鍋壓閥，加壓至0.1兆帕，計(jì)時(shí)2 min，閉電源，自然降壓開(kāi)鍋取出法蘭缸，冷卻至室溫。(2)電爐煮沸法：將裝有切片的金屬染色提籃放入10 mM/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)的法蘭缸，然后，放入含有水的用電爐加熱的鍋內(nèi)，至鍋內(nèi)的水沸騰開(kāi)始計(jì)時(shí)20 min。取出法蘭缸自然冷卻至室溫。(3)酶消化法：滴加消化酶于切片上，37 ℃ 20 min 。免疫組化染色： (1)PBS洗，2 min×3次；抗原修復(fù)；5%小牛血清白蛋白20 min；滴加一抗，37 ℃孵育2 h，PBS洗，2 min×3次；滴加二抗，37 ℃ 20 min，PBS洗，2 min×3次；滴加SABC，37 ℃ 20 min，PBS洗，2 min×3次；DAB顯色；蘇木素精襯染；中性樹(shù)膠封片。用PBS替代一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判斷：細(xì)胞染色出現(xiàn)棕黃色者為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

3種抗原修復(fù)法的抗原片，免疫組化染色的結(jié)果見(jiàn)表1。免疫組化染色組織切片結(jié)果顯示，用高壓鍋加熱抗原修復(fù)法，5種抗體均為核陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性顆粒清楚，染色背景清晰。電爐煮沸抗原修復(fù)法只有1種抗體呈陽(yáng)性。酶消化抗原修復(fù)法，隨機(jī)作了2個(gè)抗體，均陽(yáng)性且顆粒清楚，染色背景清晰，與高壓鍋加熱抗原修復(fù)法的陽(yáng)性結(jié)果無(wú)區(qū)別。

表1 3種抗原修復(fù)法對(duì)5個(gè)抗體的免疫組 化染色結(jié)果的比較

3 討論

目前，免疫組織化學(xué)應(yīng)用中常用的固定劑仍為醛類固定劑，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為組織經(jīng)10%福爾馬林固定后，抗原會(huì)被溶解、彌散、丟失或產(chǎn)生蛋白質(zhì)交聯(lián)產(chǎn)物使抗原被掩蓋，導(dǎo)致抗原性降低、免疫組化結(jié)果抗原不表達(dá)、陽(yáng)性率較低。特別是固定時(shí)間長(zhǎng)、保留久遠(yuǎn)的組織蠟塊。免疫組化是通過(guò)抗體特異地與組織中抗原結(jié)合而表達(dá)出來(lái)，所以抗原修復(fù)的方法直接影響到組織中抗原的暴露，因此不能用統(tǒng)一的修復(fù)方法，而高壓加熱法能把被掩蓋或交聯(lián)變性的抗原暴露或修復(fù)，使免疫組化的結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。特別是核陽(yáng)性的組織，適用于高壓加熱法。電爐煮沸法是抗原修復(fù)液和切片放入法蘭缸，然后再放入含有水的用電爐加熱的鍋內(nèi)，至鍋內(nèi)的水沸騰開(kāi)始計(jì)時(shí)20 min，時(shí)間長(zhǎng)，陽(yáng)性結(jié)果不佳。酶消化抗原修復(fù)法由于某試劑不足等原因，隨機(jī)作了2個(gè)抗體，均陽(yáng)性且顆粒清楚，染色背景清晰，與高壓鍋加熱抗原修復(fù)法的陽(yáng)性結(jié)果無(wú)區(qū)別，本方法可供參考。本研究提示，核陽(yáng)性表達(dá)的抗體應(yīng)選用高壓鍋抗原修復(fù)法，推測(cè)核陽(yáng)性表達(dá)的抗體也適用于酶消化抗原修復(fù)法，有待在實(shí)驗(yàn)中再進(jìn)一步探索。建議不同的陽(yáng)性定位選用不同的修復(fù)方法，更具有針對(duì)性、穩(wěn)定性，以便獲得最佳的免疫組化的陽(yáng)性結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

[1]催永興，涂靜宜，李冬梅，等．不同修復(fù)方法對(duì)免疫組化染色結(jié)果的影響[J]．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2006，22(3)：390-391．

[2]許燕云，姜國(guó)漢，吳艷霞．不同抗原修復(fù)方法對(duì)cyclin B1在腫瘤中表達(dá)的比較[J]．診斷病理學(xué)雜志，2004，11(3)：201．

[3]席淑華，郭麗，孫文娟．飲用砷暴露對(duì)子代大鼠GAD和GABA-T mRNA表達(dá)的影響[J]．中國(guó)地方病學(xué)雜志，2007，26(1)：9-11．

[4]王晉芬，田相義，叢娟，等．幾種抗原修復(fù)方法研究[J]．診斷病理學(xué)雜志，1997，4(1)：34-35．