王長(zhǎng)春 毛偉敏 凌志強(qiáng)

浙江省腫瘤醫(yī)院 浙江省腫瘤研究所腫瘤分子遺傳實(shí)驗(yàn)室

浙江省胸部腫瘤（肺、食管、乳腺）診治技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（310022）

腫瘤的表觀遺傳學(xué)研究已成為近年腫瘤研究的熱點(diǎn)問題。有研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤包括胃癌、食管癌中可見基因啟動(dòng)子區(qū)5’CpG島異常甲基化[1,2]，食管癌前病變Barrett食管中抑癌基因APC基因啟動(dòng)子區(qū)亦存在高甲基化[3]。大量研究已證實(shí)抑癌基因甲基化與食管癌相關(guān)，但多種抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)5’CpG島甲基化與腫瘤家族史的研究鮮見報(bào)道。本研究通過檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）患者中多種抑癌基因的甲基化狀態(tài)，旨在探討其與腫瘤家族史和預(yù)后的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究腫瘤易感家族提供依據(jù)。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

選取2010年2～7月浙江省腫瘤醫(yī)院76例經(jīng)病理檢查確診的ESCC患者，均為首診病例，術(shù)前未接受過放、化療以及其他任何治療。其中男61例，女15例，年齡40～76歲，中位年齡60歲。食管上/中段病變46例，下段30例；高/中分化60例，低分化16例。有腫瘤家族史（定義為兩代以內(nèi)有直系親屬曾患有惡性腫瘤）者16例，其中食管癌5例，結(jié)腸癌2例，胰腺癌2例，肺癌2例，淋巴瘤2例，白血病、胃癌和腎癌各1例；無腫瘤家族史者60例。按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）和美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)（AJCC）2009第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期5例，Ⅱ期30例，Ⅲ期40例，Ⅳ期1例。本研究方案經(jīng)浙江省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，患者均簽署知情同意書。

二、方法

1.組織DNA提取：手術(shù)切除標(biāo)本后，由專人負(fù)責(zé)取組織標(biāo)本。腫瘤組織標(biāo)本取自癌巢，癌旁正常組織取自距腫瘤邊緣5 cm處，切取后立即置于液氮-76℃保存。采用苯酚/氯仿法提取基因組DNA（杭州化學(xué)試劑有限公司），置于－20℃保存待測(cè)。

2.DNA亞硫酸氫鹽修飾：以紫外分光光度計(jì)（型號(hào)NanoDrop ND-1000）測(cè)定DNA濃度和純度，A260nm/A280nm比值≥1.8的DNA判定為合格樣本?；蚪MDNA行亞硫酸氫鹽修飾和純化，具體步驟按EpiTect Bisulfite Kits（Qiagen）說明書操作。

3.MSP 檢測(cè)：參照 APC、RARβ2、CDH1、p16INK4a和RASSF1A基因序列，分別設(shè)計(jì)5’CpG島特異性甲基化和非甲基化引物，所有引物由Invitrogen公司合成（見表1）。PCR反應(yīng)體系20μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 10 min；95℃變性 15 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min[2]。采用2-△CT法定量分析各抑癌基因的甲基化狀態(tài)。以體外經(jīng)SssⅠ甲基轉(zhuǎn)移酶處理過的人類基因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier分析，終點(diǎn)事件為腫瘤復(fù)發(fā)或死亡，觀察無進(jìn)展生存期（progression-free survival,PFS）。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)

ESCC患者腫瘤組織APC、RARβ2、CDH1、p16INK4a、RASSF1A的甲基化率分別為44.7%、72.4%、72.4%、86.8%、55.3%，均顯著高于相應(yīng)癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）（見表 2）。

表2 ESCC患者腫瘤組織和癌旁正常組織中各抑癌基因甲基化率的比較 n（%）

二、甲基化與腫瘤家族史

16例有腫瘤家族史的ESCC患者中，腫瘤組織 APC、RARβ2、CDH1、p16INK4a、RASSF1A的甲基化率分別為75.0% （12/16）、100% （16/16）、93.8%（15/16）、93.8%（15/16）、100%（16/16）；60 例無腫瘤家族史者中，甲基化率分別為36.7%（22/60）、65.0%（39/60）、66.7%（40/60）、85.0%（51/60）和 43.3%（26/60），兩組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 各抑癌基因甲基化特異性PCR反應(yīng)引物和片段長(zhǎng)度

三、生存分析

66例ESCC患者有隨訪結(jié)果，其中18例復(fù)發(fā)或死亡，另有10例失訪。經(jīng)Kaplan-Meier分析，CDH1和RASSF1A非甲基化患者的平均生存期均明顯高于甲基化患者（P=0.015、P=0.016），其余 3種抑癌基因甲基化與否對(duì)預(yù)后的影響無明顯差異（見表 3、圖 1）。

討 論

腫瘤的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中抑癌基因起重要調(diào)控作用。APC基因涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移乃至細(xì)胞凋亡，其調(diào)控方式是與微管結(jié)合，調(diào)節(jié)胞液中β-catenin蛋白水平；RARβ2是一種抑癌基因，定位于染色體3p24，通過在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)化成視黃酸而發(fā)揮作用，其啟動(dòng)子區(qū)甲基化可引起癌癥的發(fā)生[4]；p16基因主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來參與腫瘤的發(fā)生，其調(diào)節(jié)機(jī)制可能通過Rb基因依賴途徑實(shí)現(xiàn)[5]；CDH1基因參與同型細(xì)胞間黏附；RASSF1A除具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用之外，還可促進(jìn)凋亡和調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性[6]。

業(yè)已證實(shí)抑癌基因在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[7]，其表遺傳沉默與腫瘤侵襲、生長(zhǎng)、新生血管生成、轉(zhuǎn)移行為密切相關(guān)，可能是食管癌發(fā)生、發(fā)展以及治療后復(fù)發(fā)的重要因素之一，并影響患者的總體生存率。多項(xiàng)研究證實(shí)ESCC組織中存在多種抑癌基因的高甲基化。且在癌變過程中，不同組織類型的基因甲基化狀態(tài)亦不相同[8]。Zare等[9]發(fā)現(xiàn)44.4%的ESCC患者發(fā)生APC啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，其兩年生存率更低，而正常組織中未發(fā)生甲基化；Kim等[10]的研究結(jié)果顯示50例ESCC患者中，APC、RARβ2、p16、RASSF1A 的 甲 基 化 率 分 別 為46%、34%、10%和 14%；Kuroki等[11]的研究發(fā)現(xiàn)ESCC細(xì)胞株和 ESCC組織中均可見 RARβ2、RASSF1A高甲基化，且腫瘤組織的甲基化率高于癌旁組織；Lee等[12]發(fā)現(xiàn)251例ESCC患者中p16、RARβ2、CDH1 的甲基化率分別為 52%、25%和43%，且CDH1高甲基化可作為TNM分期Ⅰ期患者的復(fù)發(fā)指標(biāo)；Taghavi等[13]發(fā)現(xiàn)ESCC患者腫瘤組織p16INK4a甲基化率顯著高于相鄰癌旁組織。本研究中，ESCC 患者腫瘤組織中 APC、RARβ2、CDH1、p16INK4a、RASSF1A的甲基化率分別為44.7%、72.4%、72.4%、86.8%、55.3%，均顯著高于相應(yīng)癌旁正常組織。由此可見，各種抑癌基因甲基化可能在ESCC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

表3 ESCC患者各抑癌基因甲基化Kaplan-Meier分析

圖1 CDH1和RASSF1A甲基化和非甲基化患者的生存曲線

Abbaszadegan等[14]在ESCC患者家族成員中發(fā)現(xiàn)，p16啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化率為64.3%，而健康志愿者為0，說明p16異常甲基化可作為高危ESCC家族成員腫瘤的早期鑒別標(biāo)記。本研究發(fā)現(xiàn)ESCC患者 APC、RARβ2、CDH1、RASSF1A 基因甲基化與腫瘤家族史顯著相關(guān)，而p16INK4a基因甲基化與腫瘤家族史無關(guān)。

目前抑癌基因甲基化與ESCC患者預(yù)后關(guān)系的報(bào)道少見。本研究中，CDH1和RASSF1A甲基化患者的生存期明顯低于非甲基化患者，但因隨訪時(shí)間過短，故不能肯定其臨床意義，尚需進(jìn)一步隨訪并重新分析才能得出可信的結(jié)果。

由此可見，對(duì)具有腫瘤家族史的健康家庭成員行多種抑癌基因甲基化檢測(cè)，并密切隨訪甲基化陽(yáng)性者，可在一定程度上早期診斷和治療ESCC等疾病。但該結(jié)論尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 張斌,曹俊,陳敏,等.死亡相關(guān)蛋白激酶基因高甲基化在胃癌形成過程中作用的初步研究.胃腸病學(xué),2008,13(12):737-740.

2 鄭秋青,凌志強(qiáng),李沛,等.RASSF1A在食管鱗癌組織中的表達(dá)、甲基化狀態(tài)及其與預(yù)后之間的關(guān)系.世界華人消化雜志,2010,18(29):3134-3139.

3 宋明全,常英,朱金水.質(zhì)子泵抑制劑治療對(duì)Barrett食管APC基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的影響.胃腸病學(xué),2009,14(9):536-539.

4 許旭,孫敬巖,顧林,等.從表觀遺傳學(xué)角度探討RAR-β2基因在乳腺癌發(fā)生中的作用.中國(guó)腫瘤臨床,2010,37(23):1326-1329,1333.

5 孫樹漢主編.遺傳與疾病.第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2009.157-179.

6 周紹榮,徐美榮,陳云.RASSF1A基因甲基化與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展.實(shí)用癌癥雜志,2008,23(5):540-542.

7 Raja S,Godfrey TE,Luketich JD.The role of tumor suppressor genes in esophageal cancer.Minerva Chir,2002,57(6):767-780.

8 Yang HH,Hu N,Wang C,et al.Influence of genetic background and tissue types on global DNA methylation patterns.PLoS One,2010,5(2):e9355.

9 Zare M,Jazii FR,Alivand MR,et al.Qualitative analysis of Adenomatous Polyposis Coli promoter: hypermethylation,engagementand effectson survivalof patients with esophageal cancer in a high risk region of the world,a potential molecular marker.BMC Cancer,2009,9:24.

10 Kim YT,Park JY,Jeon YK,et al.Aberrant promoter CpG island hypermethylation of the adenomatosis polyposis coli gene can serve as a good prognostic factor by affecting lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the esophagus.Dis Esophagus,2009,22(2):143-150.

11 Kuroki T,Trapasso F,Yendamuri S,et al.Allele loss and promoter hypermethylation of VHL, RAR-beta,RASSF1A,and FHIT tumorsuppressorgeneson chromosome 3p in esophageal squamous cell carcinoma.Cancer Res,2003,63(13):3724-3728.

12 Lee EJ,Lee BB,Han J,et al. CpG island hypermethylation of E-cadherin (CDH1)and integrin alpha4 is associated with recurrence of early stage esophageal squamous cell carcinoma.Int J Cancer,2008,123(9):2073-2079.

13 Taghavi N,Biramijamal F,Sotoudeh M,et al.p16INK4ahypermethylation and p53,p16 and MDM2 protein expression in Esophageal Squamous Cell Carcinoma.BMC Cancer,2010,10:138.

14 Abbaszadegan MR,Raziee HR,Ghafarzadegan K,et al.Aberrant p16 methylation,a possible epigenetic risk factor in familial esophageal squamous cell carcinoma.Int J Gastrointest Cancer,2005,36(1):47-54.