季洪強，劉 慧，宋桂良，付志遠，李衛(wèi)華，湯繼華

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州450002)

優(yōu)良雜交種的選育與推廣是世界玉米產(chǎn)量不斷提高的重要保證，然而利用常規(guī)的育種方式選育一個優(yōu)良玉米雜交種往往需要6～10 a的周期［1，2］，無法滿足生產(chǎn)上對品種更新?lián)Q代的快速要求.玉米育種周期長的主要限制因素在于一個自交系的純合往往需要6～8代，因此如何加速自交系選育過程中的基因型純合是提高玉米育種效率的關(guān)鍵.而高等植物中存在的孤雌生殖和孤雄生殖現(xiàn)象為玉米自交系的加速選育提供了一條有效的策略.COE［3］最早報道自交系Stock 6的授粉后代中能夠產(chǎn)生2.29%的孤雌生殖單倍體，隨后許多學(xué)者對Stock 6的孤雌生殖單倍體的誘導(dǎo)效率進行了改良選擇［4，5］，并在 20 世紀(jì)育成了誘導(dǎo)率更高的孤雌生殖誘導(dǎo)系，玉米單倍體育種進入了實用化階段，有效提高了玉米育種效率［6～8］.中國玉米育種工作者先后開展了玉米孤雌誘導(dǎo)系的選育和加倍研究工作，選育出了農(nóng)大高誘1號、高誘6號、吉高誘系3號等誘導(dǎo)概率較高的誘導(dǎo)系，并用于商業(yè)良種［9～11］.但是，由于單倍體植株的誘導(dǎo)率和單倍體的加倍率是制約單倍體育種的關(guān)鍵因素，多數(shù)學(xué)者通過對不同單倍體誘導(dǎo)系的改良以提高誘導(dǎo)率［9～12］，同時對單倍體的加速技術(shù)進行了大量研究，利用秋水仙素配合其它試劑進行種子、胚芽處理和利用除草劑如胺磺樂靈等方法進行幼苗處理均取得了較好的加倍效果［13～20］.但是，這些方法操作相對較復(fù)雜，增加了實際應(yīng)用過程中的難度.本研究擬在前人研究的基礎(chǔ)上，探討不同生態(tài)條件下的單倍體誘導(dǎo)率和加倍率，并對加倍方法進行改良，探索一套經(jīng)濟、便捷、高效、實用的玉米單倍體加倍方法.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以自選孤雌生殖誘導(dǎo)系 TY1為父本，以農(nóng)大108、鄭單958、先玉 335、浚單 18、豫單 811 等 5 個優(yōu)良玉米雜交種為母本，分別于2009年和2010年種植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)(鄭州)、海南基地(海南省三亞市樂東縣九所鎮(zhèn)山腳村)和甘肅基地(張掖地區(qū)玉米原種場)，在母本吐絲后的第8天開始采用嚴(yán)格的人工授粉進行雜交誘導(dǎo)，并在種子達到生理成熟時收獲，人工挑選單倍體子粒.

1.2 染色體加倍方法

將單倍體種子用體積分數(shù)3%的H2O2水浸泡10 min消毒后，用清水沖洗干凈等待處理.單倍體的加倍采用3種方法.①干種子處理:加羥基脲26°C恒溫處理6 h，再用清水沖洗干凈(約2 h)，用不同質(zhì)量濃度的秋水仙素(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g·L-1)和胺磺樂靈(質(zhì)量濃度梯度 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g·L-1)試劑(含 2%DMSO)處理 9 h，清水沖洗干凈(約2 h)后播種.②萌動種子處理:先用清水浸泡10 h(26°C);然后放在發(fā)芽盒遮光培養(yǎng)12 h(種子萌動露白);再用干種子處理方法處理.③胚芽處理:待胚芽鞘長出2～3 mm時剪去.對剩余部分進行試劑處理;清水沖洗干凈(約2 h)后直接播種.

1.3 單倍體雌雄育性的觀察標(biāo)準(zhǔn)

抽雄后對凡能產(chǎn)生可散粉花藥的植株記為雄性可育株，否則記為不育株.用正常二倍體玉米花粉給雄性不育株的雌穗授粉，授粉后能夠結(jié)實的記為雌性可育株，不結(jié)實的記為雌性不育株.散粉率和結(jié)實率的計算方法如下:

散粉率/%=散粉株/成活單倍體總株數(shù)×100%

結(jié)實穗率/%=結(jié)實穗數(shù)/成活單倍體總株數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型雜交種的單倍體誘導(dǎo)效果

對不同雜交種的單倍體誘導(dǎo)率進行方差分析(表1).結(jié)果表明，單倍體誘導(dǎo)率在3個地點間和5個品種間均達到了極顯著水平.說明單倍體的誘導(dǎo)率不僅受被誘導(dǎo)基因型的影響，同時還與環(huán)境條件有密切的關(guān)系.

表1 不同雜交種在不同地點單倍體誘導(dǎo)率的方差分析Table 1 Variance analysis of haploid induction rate in different varieties three locations

從表2可以看出，誘導(dǎo)系TY1對同一品種在不同地點間的誘導(dǎo)率明顯不同，海南的誘導(dǎo)率最高，與甘肅和鄭州的誘導(dǎo)率相比達到了顯著水平.而不同基因型雜交種的單倍體誘導(dǎo)率同樣存在顯著差異(表2)，如958(4.48%)、浚單18(4.29%)和先玉335(4.14%)的平均誘導(dǎo)率與豫單811(3.14%)和農(nóng)大108(2.06%)的平均誘導(dǎo)率達到了顯著水平;而豫單811的平均誘導(dǎo)率與農(nóng)大108相比同樣達到了顯著水平.

2.2 不同加倍方法的加倍效果分析

利用秋水仙素和胺磺樂靈分別對鄭單958的單倍體進行了加倍處理，比較了3種加倍方法加倍后的植株成活率及散粉率.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著秋水仙素含量的提高，干種子處理的單倍體加倍后的成活率未受到影響，但散粉率明顯提高;萌動種子處理后的單倍體成活率也未受到影響，但散粉率先升后降;胚芽處理的單倍體處理后的成活率和散粉率都呈明顯下降趨勢(表3).而隨著胺磺樂靈含量的提高，干種子處理的單倍體加倍后的成活率與散粉率的變化趨勢與秋水仙素處理一致;萌動種子處理的單倍體成活率基本上未受影響，胚芽處理的單倍體加倍后的成活率逐漸下降，兩者的散粉率都表現(xiàn)先升高后降低的趨勢(表4).綜合分析可以看出，用0.6 g·L-1的秋水仙素對萌動的玉米種子進行處理，其加倍效果最好，散粉率可以達71.25%(表3).

表2 不同品種不同地點的誘導(dǎo)率與多重比較分析Table 2 The haplod induction rate of different varieties at different locations and multiple comparison analysis %

表3 鄭單958單倍體在秋水仙素處理下的加倍效果Table 3 The doubled effect of Zhengdan 958 haploid under different Colchicine concentration treatment

表4 鄭單958單倍體在胺黃樂靈處理下的加倍效果Table 4 The doubled effect of Zhengdan 958 haploid under different Oryzalin concentration treatment

2.3 不同環(huán)境條件下單倍體的加倍率

用0.6 g·L-1的秋水仙素對不同雜交種誘導(dǎo)獲得的單倍體萌動種子在甘肅省張掖地區(qū)原種場和海南省三亞市進行加倍率試驗(表5).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同玉米雜交種的單倍體加倍后的植株在2個環(huán)境條件下的散粉率和結(jié)實率存在一定的差異，浚單18和鄭單958的單倍體在甘肅加倍后的植株散粉和結(jié)實率較高，分別達到了72.5%，71.25%和36.25%，38.75%.農(nóng)大108的單倍體加倍后的植株散粉率和結(jié)實率在2個環(huán)境中均較低.但是，先玉335的單倍體在海南加倍后的植株散粉率和結(jié)實率要高于在甘肅的加倍效果，而其余4個雜交種的單倍體在甘肅加倍后的植株散粉率和結(jié)實率均高于在海南加倍后的效果.總體而言，在甘肅進行玉米單倍體的加倍效果要明顯好于在海南的加倍效果.

表5 不同地點間單倍體加倍后散粉率與結(jié)實率的比較Table 5 Comparison of the pollen plant rate and seed setting rate of haploid

3 討論

多數(shù)研究證明，不同遺傳背景的材料單倍體誘導(dǎo)率存在明顯的差異［21～23］.CHASE 認為，這種現(xiàn)象與被誘導(dǎo)材料的基因型有很大關(guān)系，是由于母本基因型所產(chǎn)生的雌配子中有害基因的概率不同所造成的，經(jīng)過多代農(nóng)藝性狀改良的材料作母本比未經(jīng)改良材料產(chǎn)生單倍體概率高［24］.本研究發(fā)現(xiàn)，不但遺傳背景影響著單倍體的誘導(dǎo)率，而且不同的環(huán)境條件同樣在一定程度上影響著單倍體的誘導(dǎo)效率.由于中國多數(shù)玉米育種單位均在海南進行冬季加代，因此，應(yīng)該在海南冬季開展單倍體的誘導(dǎo)工作，以提高單倍體的誘導(dǎo)效率.

玉米單倍體植株能否正常自交產(chǎn)生后代，取決于其雌雄育性是否恢復(fù).正常情況下，單倍體雌穗的自然加倍率較高［9，25］，而雄穗的自然加倍率較低，一般情況下在 10% 左右［7，17，26］.因此，玉米單倍體的雄穗能否產(chǎn)生正常的花粉是制約單倍體加倍率的關(guān)鍵因素.為提高單倍體雄穗的加倍率，不同學(xué)者利用不同的方法對單倍體的加倍率進行了研究，提出了不同的單倍體加倍方法，單倍體雄穗的加倍率明顯得到了提高［13～20］，從而為商業(yè)化育種中的大規(guī)模應(yīng)用提供保證.本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，探討了利用不同質(zhì)量濃度的秋水仙素對萌動的單倍體種子進行處理，與干種子處理相比，加倍率明顯提高.同時，比人工剪去胚芽鞘處理幼苗具有較高的成活率，在單倍體育種中具有一定的實際應(yīng)用前景.此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，單倍體在甘肅省張掖地區(qū)具有較高的加倍效率.因此，應(yīng)該充分利用中國的生態(tài)資源，在甘肅建立中國的玉米單倍體加倍育種基地，以有效提高玉米單倍體的加倍效率，加速玉米育種進程.

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