陳淑娟，姜志梅，郭嵐敏，張士嶺，孫奇峰，李麗，王長(zhǎng)山

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在孤獨(dú)癥模型鼠顳葉皮層中的表達(dá)①

陳淑娟1，姜志梅1，郭嵐敏1，張士嶺1，孫奇峰1，李麗2，王長(zhǎng)山3

目的研究顳葉皮層腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)與孤獨(dú)癥的關(guān)系。方法孕12.5 d W istar大鼠腹腔注射丙戊酸鈉(VPA)600mg/kg，觀察仔鼠(VPA組)的行為學(xué)特征，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)VPA組與對(duì)照仔鼠(對(duì)照組，腹腔注射等量生理鹽水)顳葉皮層BDNF表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，VPA組表現(xiàn)為低體重(P＜0.05)，睜眼時(shí)間延遲(P＜0.05)，協(xié)調(diào)性反應(yīng)差(P＜0.05)，方向趨向性反應(yīng)遲緩(P＜0.05)；社交行為次數(shù)減少(P＜0.05)、潛伏期延長(zhǎng)(P＜0.05)、持續(xù)時(shí)間縮短(P＜0.05)，重復(fù)行為增多(P＜0.05)。小腦浦肯野細(xì)胞數(shù)量減少。出生后1 d、7 d、14 d時(shí)，VPA組顳葉皮層BDNF表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，而出生后35 d、49 d時(shí)，VPA組顳葉皮層BDNF表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。結(jié)論顳葉BDNF表達(dá)參與孤獨(dú)癥的發(fā)病過(guò)程。

孤獨(dú)癥；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；丙戊酸鈉；大鼠

[本文著錄格式]陳淑娟，姜志梅，郭嵐敏，等.腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在孤獨(dú)癥模型鼠顳葉皮層中的表達(dá)[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2012,18(5):426-429.

孤獨(dú)癥(autism)又稱自閉癥，是一種嚴(yán)重的廣泛性腦發(fā)育障礙性疾病。通常3歲以前發(fā)病，至今病因未明。顳葉與社會(huì)知覺、語(yǔ)言和“心理理論”能力有關(guān)，孤獨(dú)癥患兒存在上述能力缺陷[1]。顳葉與孤獨(dú)癥發(fā)病的關(guān)系近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。本研究觀察腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在孤獨(dú)癥動(dòng)物模型鼠顳葉皮層中的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 丙戊酸鈉(VPA)：SIGMA公司；兔抗BDNF抗體(l∶1000)、生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG(即用型)、SABC復(fù)合物(即用型)、Cy3-山羊抗兔(l∶200)：武漢博士德生物公司。

1.2 模型制備 健康成年清潔級(jí)W istar雄性(體重280～300 g)大鼠30只，雌性(體重220～250 g)大鼠60只，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于佳木斯大學(xué)專用動(dòng)物房，給予充分飼料和飲水。日光燈維持光照，每天12 h(7:00～19:00)，環(huán)境安靜，室溫25℃左右。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)程序均嚴(yán)格遵照佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條款執(zhí)行。

環(huán)境適應(yīng)2周后，于17:00以雌雄比2∶1合籠，次日8:00查陰道涂片，以查得精子為妊娠第1天，孕鼠另籠飼養(yǎng)。

參照Schneider等的方法[2-4]，在孕12.5 d時(shí)，模型組孕鼠(n=50)腹腔注射丙戊酸鈉600mg/kg(丙戊酸鈉粉用生理鹽水配成250mg/m l溶液)；對(duì)照組(n=10)孕鼠腹腔注射等量生理鹽水。模型組母鼠產(chǎn)下的仔鼠記為丙戊酸鈉組(VPA組,n=225)，對(duì)照組母鼠產(chǎn)下的仔鼠記為生理鹽水組(Con組,n=90)；出生當(dāng)日記為生后第1天(P1)。

1.3 模型鑒定[2-4]

1.3.1 發(fā)育學(xué)測(cè)試

1.3.1.1 體重 取VPA組和Con組P7、P14、P21、P56和P90雄鼠各10只稱重。

1.3.1.2 睜眼時(shí)間測(cè)定 取VPA組及Con組鼠各10只，于P12、P13、P14、P15和P16觀察睜眼情況。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：2只眼睛均未睜；1分：1只眼睛睜開；2分：2只眼睛均睜開。

1.3.1.3 方向趨向性檢測(cè)(傾斜板試驗(yàn)) 取VPA組及Con組鼠各10只，于P7、P8、P9、P10觀察方向趨向性情況：將鼠頭朝下放在25°光滑傾斜平面上，觀察鼠轉(zhuǎn)身180°所用時(shí)間。

1.3.1.4 協(xié)調(diào)性檢測(cè)(游泳試驗(yàn)) 取VPA組及Con組P9、P11、P13和P15鼠各10只，逐個(gè)放于28℃恒溫槽中央，觀察5～10 s，根據(jù)耳與頭頂部處于水面位置評(píng)分：0分：頭頂和鼻在水面以下；1分：鼻在水面以下，頭頂在水面以上；2分：鼻和頭頂在水面以上或與水面平齊，雙耳在水面以下；3分：鼻和頭頂位置與2分標(biāo)準(zhǔn)相同，但水位線在耳中間；4分：鼻和頭頂位置與2分標(biāo)準(zhǔn)相同，水位線在耳以下。

1.3.2 行為學(xué)檢測(cè)

1.3.2.1 社會(huì)交往行為檢測(cè) 于P35時(shí)檢測(cè)。從兩組仔鼠中分別選擇被測(cè)鼠和搭檔鼠各6只，兩者之間組別、月齡、性別相同，體重差別≤15 g，分籠飼養(yǎng)。檢測(cè)在規(guī)格為60×60×60 cm曠場(chǎng)箱內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前2 d，所有鼠被單獨(dú)放在曠場(chǎng)箱內(nèi)，每次5m in，每天2次，連續(xù)2 d，以減輕對(duì)新環(huán)境的焦慮。實(shí)驗(yàn)前1 h隔離被測(cè)鼠。被測(cè)鼠和搭檔鼠隨機(jī)配對(duì)，共同置于曠場(chǎng)箱中10m in，播放背景音樂(lè)。記錄社會(huì)行為潛伏期(從進(jìn)入曠場(chǎng)到出現(xiàn)社交行為的時(shí)間)、10m in內(nèi)社會(huì)行為次數(shù)、每次社會(huì)行為持續(xù)時(shí)間。社交行為包括：一只鼠緊跟同伴保持同步、鼻-鼻嗅探(嗅同伴鼻子和臉)、推擠爬行(與同伴身體接觸，包括在同伴身體下推擠，在同伴和墻壁或地板之間推擠，爬過(guò)同伴的身體或在其身體之下)和給同伴理毛。非社交行為包括自我理毛和區(qū)域探測(cè)(繞著某一區(qū)域走，嗅探或挖墊草)。

1.3.2.2 重復(fù)行為檢測(cè) 重復(fù)行為是指一系列行為以正常模式出現(xiàn)，但持續(xù)時(shí)間異常[5]。于P21、P35、P49時(shí)VPA組和Con組各取10只在干凈曠場(chǎng)中進(jìn)行，每只鼠先適應(yīng)環(huán)境10m in，然后記錄10m in內(nèi)鼠用于整理身體所有部位毛的累積時(shí)間。播放背景音樂(lè)。由2位觀察員用2塊秒表同時(shí)觀看錄像記時(shí)，取平均值。

1.3.3 形態(tài)學(xué)檢測(cè) 取VPA組和Con組P14、P21、P35、P49鼠各5只，制備Nissl染色標(biāo)本切片。每只取5張小腦切片，應(yīng)用Olym Pus顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)，對(duì)小腦浦肯野細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行分析。每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野，取平均值。

1.4 免疫組化檢測(cè) 取VPA組和Con組P7、P14、P21、P35、P49鼠各5只麻醉，開胸，從心耳部灌洗后迅速斷頭取腦，置中性甲醛中固定，石蠟包埋，切片厚20μm，每只取6張，5張采用SABC法行顳葉皮層BDNF免疫組織化學(xué)染色，1張用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。應(yīng)用Olympus顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)測(cè)定積分光密度(IOD)。每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均用(±s)表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)育

2.1.1 體重 P7、P14時(shí)，VPA組鼠體重與Con組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；P21、P56、P90時(shí)，VPA組體重低于Con組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組體重比較(g)

2.1.2 睜眼時(shí)間 P12、P13、P14時(shí)，VPA組鼠睜眼時(shí)間評(píng)分較Con組低(P＜0.05)；P15時(shí)，兩組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。P16時(shí)及以后，兩組鼠均完全睜眼。見表2。

2.1.3 方向趨向性 與Con組比較，各時(shí)間點(diǎn)VPA組鼠轉(zhuǎn)身所用時(shí)間均長(zhǎng)(P＜0.05)。見表3。

2.1.4 協(xié)調(diào)性反應(yīng) 與Con組比較，P9、P11、P13時(shí)VPA組鼠評(píng)分低(P＜0.05)；P15時(shí)，兩組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見表4。

表2 各組睜眼情況評(píng)分比較

表3 各組轉(zhuǎn)身時(shí)間比較(s)

表4 各組游泳評(píng)分比較

2.2 行為

2.2.1 社會(huì)交往行為 與Con組比較，VPA組鼠社交行為次數(shù)減少(P＜0.05)，社會(huì)行為潛伏期顯著增加(P＜0.001)，社交行為持續(xù)時(shí)間縮短(P＜0.05)。見表5。

表5 不同組社會(huì)交往行為比較

2.2.2 重復(fù)行為 與Con組相比較，P21、P35、P49時(shí)VPA組鼠理毛行為累積時(shí)間增多(P＜0.001)。見表6。

表6 各組理毛行為累積時(shí)間比較(s)

2.3 形態(tài)學(xué) P14、P21時(shí)，VPA組鼠小腦浦肯野細(xì)胞數(shù)與Con組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；P35、P49時(shí)，VPA組鼠小腦浦肯野細(xì)胞數(shù)減少(P＜0.05)。見表7。

2.4 BDNF表達(dá) P1、P7、P14時(shí)，VPA組鼠顳葉皮層IOD值明顯高于Con組對(duì)應(yīng)部位IOD值(P＜0.01)；P35、P49時(shí)，VPA組IOD值明顯低于Con組(P＜ 0.01)。見表8。

表7 各組小腦浦肯野細(xì)胞數(shù)比較

3 討論

瑞典研究顯示，約30%孤獨(dú)癥兒童母親在妊娠20～24 d有應(yīng)用鎮(zhèn)靜劑史[6-7]。丙戊酸鈉可能通過(guò)促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，減少小腦浦肯野細(xì)胞，降低內(nèi)啡肽和增加5-羥色胺等機(jī)制導(dǎo)致孤獨(dú)癥[8]。本研究VPA組鼠表現(xiàn)的發(fā)育落后、行為異常和形態(tài)學(xué)異常，支持丙戊酸鈉致孤獨(dú)癥鼠模型的有效性。

顳葉皮質(zhì)功能異常與孤獨(dú)癥發(fā)病密切相關(guān)。黨桂娟等采用單光子發(fā)射斷層掃描(SPECT)進(jìn)行腦血流灌注顯像，研究顯示83%孤獨(dú)癥患者腦血流灌注降低，其中78%的病灶在顳葉、頂枕葉及海馬回、扣帶回等邊緣系統(tǒng)[9]。Goldberg等利用磁共振成像平面回波序列的血氧水平依賴技術(shù)(BOLD-fMRI)，顯示孤獨(dú)癥患兒左側(cè)顳上回信號(hào)增強(qiáng)[10]。Nelson等應(yīng)用免疫親和層析法對(duì)新生兒時(shí)保存的血液樣品研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，孤獨(dú)癥組新生兒血液樣品中BDNF水平較高，認(rèn)為BDNF高水平表達(dá)反映了區(qū)域代償機(jī)制或者是孤獨(dú)癥發(fā)病過(guò)程的一個(gè)組成部分[11]。這一結(jié)果與本研究出生后1 d、7 d(相當(dāng)于新生兒)結(jié)果一致。

BDNF參與BDNF-Akt-Bcl-2抗凋亡通路。我們推測(cè)，BDNF高表達(dá)可能是一種保護(hù)反應(yīng)，這種自我保護(hù)反應(yīng)可能與孤獨(dú)癥典型癥狀在嬰幼兒期表現(xiàn)不明顯有關(guān)。Sheikh等研究發(fā)現(xiàn)，孤獨(dú)癥患者大腦中BDNF水平下降，導(dǎo)致調(diào)節(jié)Bcl-2的Akt激酶表達(dá)和磷酸化下降[12]，表明BDNF-Akt-Bcl-2抗凋亡信號(hào)通路下調(diào)是導(dǎo)致孤獨(dú)癥發(fā)病的一個(gè)潛在機(jī)制。

出生后35 d，與正常組相比，孤獨(dú)癥組BDNF表達(dá)降低，BDNF-Akt-Bcl-2抗凋亡通路下調(diào)，導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞凋亡增加。膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)的支架，其凋亡增加使神經(jīng)纖維難以遠(yuǎn)程遷移，可解釋孤獨(dú)癥的社交互動(dòng)損害；神經(jīng)纖維只在局部反復(fù)聯(lián)系，可解釋孤獨(dú)癥的重復(fù)行為[8]。

BDNF生物作用廣泛，是大腦發(fā)育和功能的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果表明，顳葉BDNF表達(dá)可能參與孤獨(dú)癥的發(fā)病過(guò)程。對(duì)于其具體發(fā)病途徑，還需要在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行研究。另外，是否可以通過(guò)測(cè)定BDNF水平來(lái)進(jìn)行孤獨(dú)癥早期診斷，或者BDNF水平是否可作為繼續(xù)發(fā)展為孤獨(dú)癥的一個(gè)標(biāo)志，還需大量基礎(chǔ)及臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

[1]Meresse IG,Zilbovicius M,Boddaert N,et al.Autism severity and temporal lobe function abnormalities[J].Ann Neurol, 2005,58(3):462-465.

[2]Schneider T,Przew lockiR.Behavioral alterations in rats prenatally exposed to valproic acid:animalmodelof autism[J].Neuropsychopharmacology,2005,30(1):80-89.

[3]Schneider T,Przew locki R.Environmental enrichment reverses behavioral alterations in rats prenatally exposed to valproic acid:issues for a therapeutic approach in autism[J].Neuropsychopharmacology,2006,31:36-46.

[4]Schneider T,Roman A,Basta-Kaim A,et al.Gender-specific behavioral and immunological alterations in an animalmodel of autism induced by prenatal exposure to valproic acid[J]. Psychoneuroendocrinology,2008,33(6):728-740.

[5]Silverman JL,Yang M,Lord C,et al.Behavioural phenotyping assays for mouse models of autism[J].Nature Rev Neurosci, 2010,11(7):490-502.

[6]M iller MT,Strom land K.Thalidom ide embryopathy:an insight into autism?[J].Teratology,1993,47:387-388.

[7]Strom land K,Nordin V,M iller M,et al.Autism in thalidom ide embryopathy:a population study[J].Dev M ed Child Neurol, 1994,36(4):351-356.

[8]喻東山.丙戊酸鈉對(duì)女性生殖的不良影響[J].國(guó)際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志,2008,35(6):527-530.

[9]黨桂娟,裴丹.孤獨(dú)癥兒童的腦血流變化分析[J].中國(guó)誤診學(xué)雜志,2010,10(7):1575-1576.

[10]Goldberg MC,Spinelli S,Joel S,et al.Children with high functioning autism show increased prefrontal and temporal cotex activity during error monitoring[J].Dev Cogn Neurosci, 2011,1(1):47-56.

[11]Nelson KB,Grehter JK,Croen LA,et al.Neuropeptides and neurorotphins in neonatal blood of children with Autism or mental retardation[J].Ann Neuorl,2001,49(5):597-606.

[12]Sheikh AM,M alik M,Wen G,et al.BDNF-Akt-Bcl2 antiapoptotic signaling pathway is comprom ised in the brain of autistic subjects[J].NeurosciRes,2010,88(12):2641-2647.

第24屆全國(guó)脊柱脊髓學(xué)術(shù)會(huì)議征文通知

由中國(guó)殘疾人康復(fù)協(xié)會(huì)脊髓損傷康復(fù)專業(yè)委員會(huì)、國(guó)際脊髓學(xué)會(huì)中國(guó)脊髓損傷學(xué)會(huì)主辦，吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院承辦的第24屆全國(guó)脊柱脊髓學(xué)術(shù)會(huì)議將于2012年8月3日～6日在吉林省長(zhǎng)春市舉行。會(huì)議交流形式分為大會(huì)發(fā)言和展板專題討論。屆時(shí)將有歐美、亞太地區(qū)、中國(guó)大陸及港、澳、臺(tái)地區(qū)的著名專家為大會(huì)作學(xué)術(shù)報(bào)告，推出最新基礎(chǔ)研究和臨床成果及學(xué)術(shù)動(dòng)態(tài)等。歡迎骨科脊柱外科、康復(fù)醫(yī)學(xué)科、神經(jīng)學(xué)科、泌尿外科、中醫(yī)科、腫瘤科、放射科及相關(guān)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的同仁踴躍參加并積極投稿。

參會(huì)或投稿請(qǐng)登錄會(huì)議網(wǎng)站（http://www.cscc5413.com）辦理投稿、注冊(cè)和預(yù)約參會(huì)等事宜。會(huì)議注冊(cè)費(fèi)：1200元/人；7月3日前網(wǎng)上注冊(cè)優(yōu)惠價(jià)1000元/人；學(xué)生憑學(xué)生證注冊(cè)費(fèi)600元/人。授予中國(guó)醫(yī)院協(xié)會(huì)繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育Ⅰ類學(xué)分3分。

征文要求：尚未在國(guó)家級(jí)以上學(xué)術(shù)會(huì)議交流或國(guó)內(nèi)外雜志上公開發(fā)表；800字左右文章摘要，w ord文檔，宋體，標(biāo)題四號(hào)字，正文五號(hào)字。論文應(yīng)具有先進(jìn)性、科學(xué)性和實(shí)用性，論點(diǎn)鮮明、結(jié)構(gòu)嚴(yán)謹(jǐn)、真實(shí)可靠；投稿格式：包括中文題目、作者、單位、中文摘要（目的、方法、結(jié)果、結(jié)論）、關(guān)鍵詞，同時(shí)應(yīng)附作者的聯(lián)系地址、郵編、聯(lián)系電話及E-mail地址；如大會(huì)安排發(fā)言需補(bǔ)充英文摘要；投稿方式采用網(wǎng)上注冊(cè)投稿，并注明是否參會(huì)，以便安排發(fā)言；截稿日期：2012年7月1日，逾期不予受理，優(yōu)秀論文可推薦在《中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐》雜志發(fā)表。

特別提示：請(qǐng)通過(guò)會(huì)議網(wǎng)站進(jìn)行網(wǎng)上注冊(cè)、投稿及住宿選擇，不接受紙質(zhì)稿件。會(huì)議地點(diǎn)：長(zhǎng)春國(guó)際會(huì)展中心大飯店(長(zhǎng)春市經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)會(huì)展大街100號(hào))。聯(lián)系人：楊玉輝 13804314436；許卓 15043075688；電子郵件（E-mail）：yangyuhuime@163.com。

Exp ression of Brain-derived Neurotrophic Factor in Tem poral Cortex of Autism M odel Rats

CHEN Shu-juan,JIANG Zhi-mei,GUO Lan-min,etal.DepartmentofChild Developmentand Behavior,the Third Affiliated Hospital,Children Neurological Rehabilitation Lab,JiamusiUniversity,Jiamusi154003,Heilongjiang,China

Ob jectiveTo explore the role of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)in pathogenesis of autism.M ethods12.5 d pregnantW istar rats were injected sodium valproate(VPA)600 mg/kg or normal saline(NS).Their newborn rats were observed ethologically. The expression of BDNF wasmeasured in their tem poral cortex with immunohistochem ical stain.Resu ltsCompared with NS group,VPA group expressed less body mass(P＜0.05),eyes opening delay(P＜0.05),poorer coordination response(P＜0.05),slower taxis response(P＜0.05).The number of social behavior decreased(P＜0.05),latency increased(P＜0.05),duration shortened(P＜0.05),repetitive activities increased(P＜0.05).Purkinje cells reduced in cerebellum.The expression of BDNF increased significantly in temporal cortex 1 d,7 d and 14 d postnatally(P＜0.01),butdecreased 35 d and 49 d postnatally(P＜0.01).ConclusionBDNF playsa role in the pathogenesisof autism.

autism;brain-derived neurotrophic factor;sodium valproate;rats

R749.94

A

1006-9771(2012)05-0426-04

2012-01-06)

佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目(YJSCX 2011-018JD)。

1.佳木斯大學(xué)兒童神經(jīng)康復(fù)實(shí)驗(yàn)室，佳木斯大學(xué)第三附屬醫(yī)院，黑龍江佳木斯市154003；2.佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，黑龍江佳木斯市154003；3.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物教研室，黑龍江佳木斯市154003。作者簡(jiǎn)介：陳淑娟(1984-)，女，山東臨沂市人，碩士研究生，主要研究方向：腦發(fā)育與行為障礙研究。通訊作者：姜志梅。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.05.009