白敏 韓宜姚

[摘要] 目的 探討EV71感染手足口病患兒Th 細(xì)胞免疫平衡變化及其對疾病進(jìn)展的影響。 方法 選擇84例手足口病患兒分為普通組和重癥組，另選擇30例健康兒童作為對照，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測靜脈血Th1/Th2細(xì)胞表達(dá)水平變化，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清IL-4及IFN-γ表達(dá)水平變化。 結(jié)果 重癥組及普通組患兒靜脈血Th1及Th1/Th2表達(dá)水平低于對照組，Th2高于對照組，IL-4及IFN-γ表達(dá)水平低于對照組。重癥組Th1及Th1/Th2表達(dá)水平低于普通組，Th2高于普通組，IL-4及IFN-γ表達(dá)水平低于普通組。 結(jié)論 EV71感染手足口病患兒Th細(xì)胞免疫異常，可能同手足口病患兒的發(fā)病及疾病進(jìn)展有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 手足口?。荒c道病毒71；Th細(xì)胞免疫；白細(xì)胞介素4；γ干擾素

[中圖分類號] R725.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B[文章編號] 1673-9701（2012）32-0077-02

手足口病是學(xué)齡前兒童常見傳染性疾病，尤其以嬰幼兒高發(fā)，手足口病以手、足及口部位的皮損為最常見的臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致患兒的多器官功能損害甚至功能衰竭而致患兒臨床死亡。手足口病是由病毒感染引起的傳染性疾病，其中以EV71病毒及CoxA16病毒感染最為常見。近年來的研究顯示[1]，手足口病患兒在發(fā)病過程中，存在免疫功能失調(diào)的狀態(tài)，患兒體內(nèi)的細(xì)胞免疫及體液免疫均存在不同程度的異常，并且與疾病的進(jìn)展有關(guān)。本文對EV71病毒感染所致的手足口病患兒Th 細(xì)胞免疫平衡變化及其對疾病進(jìn)展的影響進(jìn)行研究?，F(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2010年10月～2012年4月我院收治的手足口病患兒84例，均經(jīng)PCR診斷為EV71病毒感染所致手足口病，其中男49例，女35例，年齡0.4～9.2歲，平均（2.9±2.4）歲，患兒按衛(wèi)生部醫(yī)政司發(fā)布的《手足口病診療指南（2010）》[2]分為普通型52例及重癥型32例；另選擇30名健康幼兒作為對照組，其中男18例，女12例，年齡1～8歲，平均（2.8±1.7）歲。患兒同對照組兒童的年齡、性別經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 主要儀器及試劑

流式細(xì)胞儀（美國BD公司），721型分光光度計(jì)（北京儀器廠），CD3+、CD4+及CD8+抗體（美國BD公司），IL-4、IFN-γ檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），IL-4抗體和IFN-γ抗體（武漢波士德生物試劑公司）。

1.3 標(biāo)本采集及檢測

1.3.1 Th細(xì)胞檢測患兒清晨抽取空腹靜脈血，加入枸櫞酸鈉抗凝，PBS緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/L，室溫暗處孵育30 min，每管加入500 μL溶血素裂解紅細(xì)胞，靜置20 min采用PBS緩沖液洗滌，500 G/min離心5 min，加入PBS緩沖液洗滌后上機(jī)檢測，采用CD3+抗體標(biāo)記T細(xì)胞，采用CD4+抗體區(qū)分Th細(xì)胞亞群，IFN-γ和IL-4抗體篩選Th1、Th2細(xì)胞。檢測完畢后采用Cellquestpro軟件進(jìn)行分析。

1.3.2 IL-4、IFN-γ表達(dá)檢測患兒靜脈血低溫分離血清，100 μL標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，100 μL樣品加入96孔板各反應(yīng)孔，37℃溫育60 min，PBS緩沖液沖洗，加入 X Biotin混勻后37℃溫育60 min，加入X HRP充分反應(yīng)，TMB顯色液，37℃溫育15 min，H2SO4終止反應(yīng)，ELISA檢測試劑盒測定IL-4、IFN-γ水平，分別于450 nm處檢測吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-4、IFN-γ濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組靜脈血Th1/Th2表達(dá)水平變化

重癥組及普通組患兒靜脈血Th1及Th1/Th2表達(dá)水平低于對照組，Th2高于對照組，重癥組Th1及Th1/Th2低于普通組，Th2高于普通組。見表1。

2.2 各組靜脈血IL-4、IFN-γ表達(dá)水平變化

重癥組及普通組患兒血清IL-4及IFN-γ表達(dá)水平低于對照組。重癥組患兒血清IL-4及IFN-γ表達(dá)水平低于普通組。見表2。

3 討論

手足口病是兒童常見傳染性疾病，以手、足部及口腔黏膜潰瘍?yōu)橹饕呐R床表現(xiàn)，嚴(yán)重者可引起循環(huán)系統(tǒng)、肺部及腦部等多系統(tǒng)損害而導(dǎo)致患兒臨床死亡。病毒感染是手足口病的致病原因，其中EV71病毒是主要的致病病毒之一。近年來的研究結(jié)果顯示[3]，病毒感染能夠?qū)е禄純旱拿庖呦到y(tǒng)功能失調(diào)，T淋巴細(xì)胞免疫在腸道病毒感染后能夠發(fā)生免疫調(diào)節(jié)作用，并且參與疾病的進(jìn)展，手足口病患兒的T淋巴細(xì)胞的數(shù)量及腫瘤均發(fā)生明顯變化，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞的免疫功能失衡，而且小兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完善，T淋巴細(xì)胞免疫的紊亂可能導(dǎo)致患兒的疾病進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，手足口病患兒的Th1表達(dá)水平下降，Th2表達(dá)水平上升，Th1/Th2比值下降，Th細(xì)胞是T細(xì)胞的亞群，分為Thl、Th2、Th0細(xì)胞，其中Th1介導(dǎo)細(xì)胞免疫，Th2主要介導(dǎo)體液免疫，Th1活化后能夠產(chǎn)生IFN-γ、TNF-β等具有炎癥拮抗作用的細(xì)胞因子，誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活化。Th2細(xì)胞活化后能夠產(chǎn)生具有強(qiáng)烈致炎作用及趨化誘導(dǎo)作用的IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的功能，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的活化及免疫球蛋白的合成[4]。在正常機(jī)體內(nèi)，Thl及Th2 能夠相互轉(zhuǎn)化并維持動態(tài)平衡，保持機(jī)體的穩(wěn)定性。但在病理狀態(tài)下，Thl及Th2細(xì)胞受外來抗原信號的刺激功能發(fā)生改變，細(xì)胞亞群的動態(tài)平衡被破壞，其中Th1亞群的功能增強(qiáng)及Th2亞群的功能減弱最為典型，Thl/Th2的比值發(fā)生變化，發(fā)生免疫平衡漂移，導(dǎo)致Th1向Th2亞群分化，機(jī)體的免疫功能發(fā)生變化[5]。細(xì)胞免疫是病毒感染的第一道防線，手足口病患兒Th1細(xì)胞數(shù)量及功能下調(diào)導(dǎo)致IFN-γ等具有免疫介導(dǎo)作用的細(xì)胞因子減少，導(dǎo)致免疫細(xì)胞對EV71病毒的殺傷作用減弱[6]。在各組比較中發(fā)現(xiàn)，手足口病患兒靜脈血的Th細(xì)胞的亞群分化發(fā)生明顯失調(diào)，手足口病患兒靜脈血Th1及Th1/Th2降低，Th2比例升高，且重癥組表現(xiàn)更為明顯，說明在手足口病患兒體內(nèi)存在Th細(xì)胞免疫漂移現(xiàn)象，并與患兒的疾病進(jìn)展情況相關(guān)。

對其下游的細(xì)胞因子IL-4及IFN-γ水平比較證實(shí)，手足口病患兒的IL-4及IFN-γ均明顯下降，且重癥組同普通組的IL-4及IFN-γ表達(dá)水平降低得更為明顯，IL-4及IFN-γ是Th2及Th1表達(dá)的細(xì)胞因子，IL-4水平的下降說明Th2細(xì)胞可能絕對數(shù)的下降或者功能降低，而表1中Th1/Th2比值的降低可能是Th1下降更為明顯所致[7]，或者T細(xì)胞免疫抑制后T細(xì)胞的絕對數(shù)量下降導(dǎo)致Th2的比例相對升高。本研究結(jié)果說明患兒的整個Th細(xì)胞免疫處于抑制狀態(tài)，Th淋巴細(xì)胞的輔助作用是B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫的必要調(diào)節(jié)因子，Th細(xì)胞免疫抑制能夠?qū)е禄純后w液免疫功能下降，B細(xì)胞表達(dá)的IgG、IgA及IgM等免疫球蛋白水平下降[8]，引起患兒的細(xì)胞免疫及體液免疫能力減弱，對病毒的清除能力下降，導(dǎo)致手足口病患兒的病情進(jìn)展。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2012-08-02）