劉子彬 劉?？? 許丹丹 封亮旗

[摘要]目的：探討不同濃度的血管抑素對血管內(nèi)皮細胞中VEGF表達的影響。方法：將體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞分為三組：對照組(空白組)、A組(16mg／L血管抑素組)、B組(32mg／L血管抑素組)，通過MTT、RT-PCR、Western-Bolt等方法檢測細胞內(nèi)VEGF的表達情況。結(jié)果：隨著血管抑素作用時間的延長和濃度的遞增對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的抑制作用也逐漸增強，且與對照組相比差異均有顯著性意義(P<0.05)。結(jié)論：血管抑素通過抑制VEGF的表達以抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖，從而抑制血管新生。[關(guān)鍵詞]血管抑素；血管內(nèi)皮細胞；血管內(nèi)皮生長因子；角膜新生血管；免疫蛋白印跡技術(shù)；時間濃度依賴

[中圖分類號]Q813.1[文獻標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455(2012)07-1165-03

血管新生是導(dǎo)致角膜透明度下降、免疫豁免功能喪失等重要因素之一，因此，抑制角膜血管新生對于眼科尤為重要；血管新生是通過血管內(nèi)皮細胞的遷移、增殖等方式實現(xiàn)血管生長：血管抑素是目前發(fā)現(xiàn)作用最強、實驗效果最好的血管生成抑制劑。本實驗觀察血管抑素對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的抑制作用。

1材料和方法

1.1材料：Lysine-Sepharose 4B(Pharmacia公司)；彈性蛋白酶、膠原酶、十二烷基磺酸鈉、氯仿、胎牛血清、二甲基亞砜、MTT(sigma公司)；Tris堿(Promega公司)：健康新生兒臍帶由解放軍第421醫(yī)院提供；蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、胰蛋白酶(華美生物工程公司)；鹽酸賴氨酸、6-氨基己酸；小鼠抗人VEGF多克隆抗體和小鼠抗人β-actin多克隆抗體(美國BD公司)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；全蛋白提取試劑盒及BCA法蛋白濃度測定試劑盒(南京凱基公司)；辣根酶標(biāo)記抗小鼠IgG(北京中杉金橋)：血管抑素K1-4(環(huán)球碧澳公司)。

細胞總RNA提取試劑盒RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒均購自TaKaRa公司。PCR引物設(shè)計利用Primier5.0設(shè)計，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成引物序列VEGF引物序列(127bp)：5-TGGACCCTGGCTTTACTGCTG-3，5-GGCAATAGCTGCGCTGGTAGA-3。GAPDH引物序列(133bp)：5_GAEAACTTTGGCATCGTGGA-3，5-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3。

1.2方法

1.2.1人臍靜脈細胞培養(yǎng)：無菌條件下切取血管，長lOcm，直徑約大于5mm；用裝有PBSA的注射器沖洗血管標(biāo)本，去除血液和凝塊：結(jié)扎一端，灌滿膠原酶溶液，結(jié)扎另一端室溫放置10min；從上端結(jié)扎處剪掉上端，收集血管內(nèi)膠原酶，移入10cm培養(yǎng)血：用10ml PBSA沖洗內(nèi)臟并收集到培養(yǎng)皿內(nèi)的膠原酶液中；將收集到的消化液用離心法在培養(yǎng)液中洗2次；收集細胞，重新懸浮于培養(yǎng)液中，接種于鋪有明膠的培養(yǎng)皿或瓶中；細胞長滿后可常規(guī)胰蛋白酶消化法傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法測定血管抑素對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的影響：取3～5代人臍靜脈內(nèi)皮細胞稀釋成單細胞后，接種于96孔板，每孔加入100μl，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO²及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。當(dāng)細胞形成單層細胞后棄上清，加入質(zhì)量濃度為16mg／L、32mg／L血管抑素，每個質(zhì)量濃度設(shè)3個復(fù)孔，對照組加入等量的含2g幾二甲基亞砜的磷酸鹽緩沖液代替(即分為三組A組：空白對照組；B組：16mg／L血管抑素組：C組：32mg／L血管抑素組)，三組均作用72h后每孔加入5mg/LMTT溶液201M繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加二甲基亞砜150μ1，振蕩10min后酶標(biāo)儀490nm讀取吸光度值(A)(參考波長為570nm)，計算不同時間、不同質(zhì)量濃度的血管抑素對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的抑制率。抑制率=(對照組A490-實驗組A490／對照組A490)×100％。

1.2.3熒光定量PCR反應(yīng)：分別采用VEGF和GAPDH引物，以cDNA為模板試劑盒說明進行PCR特異性擴增，所有實驗均重復(fù)3次，取3次結(jié)果的平均值為實驗結(jié)果。

VEGF蛋白的western blot檢測收集A組、B組、C組三組細胞。根據(jù)試劑盒說明操作，行ECL化學(xué)發(fā)光法檢測，β-actin為內(nèi)對照。

1.3觀察指標(biāo)：血管內(nèi)皮細胞在血管抑素不同濃度下的生長情況；各組血管內(nèi)皮細胞中VEGF蛋白的表達含量。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包分析，所得數(shù)據(jù)以x±s表示，MTT實驗數(shù)據(jù)采用析因設(shè)計資料方差分析，QRT-PCR結(jié)果數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗和One way ANOVA分析；方差齊的多重比較采用LSD法，方差不齊采用DennettsT3法；雙側(cè)檢驗P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1血管抑素對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的影響：MTT法測定血管抑素對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的影響不同質(zhì)量濃度的血管抑素作用于人臍靜脈內(nèi)皮細胞24h后，可見空白組細胞排列緊密，增生明顯，有連成片的趨勢；A組(16mg／L組)細胞呈點片狀增生，排列疏密有致；B組(32mg/L組)細胞呈稀疏狀排列。A490吸光度值均低于對照組，對內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用隨著血管抑素濃度的增加而增加。血管抑素作用于人臍靜脈內(nèi)皮細胞24，48，72h后細胞明顯受抑制，吸光度值均低于對照組。測定結(jié)果顯示：當(dāng)在血管抑素濃度不變的情況下，抑制作用隨時間的延長而增強(F=493.245 P=0.000)：當(dāng)血管抑素質(zhì)量濃度從0，16，32mg／L逐漸加大劑量時，人臍靜脈內(nèi)皮細胞的抑制作用也逐漸增強(F=1964.224 P=0.000)，72h時最大抑制率達到80.00％，且與對照組相比差異均有顯著性意義(P

2.2實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，以2作為統(tǒng)計量，經(jīng)方差齊性檢驗得(F=168.425 P=-0.000)，各組間比均為P=O.000，各組之間均有統(tǒng)計學(xué)差異。與空白對照組比較；A、B組VEGF mRNA的表達分別下降了約4096、73％。(如表1、2和圖1)

2.3血管抑素對VEGF蛋白表達的影響：Western blot結(jié)果顯示血管抑素作用人臍靜脈細胞后，三組中VEGF蛋白表達含量不同，且隨著血管抑素濃度的增加和時間延長而減少(圖2)。

3討論

血管生成是指毛細血管從血管周圍生成的過程“]，其在正常和病理情況下均能發(fā)生；血管抑素K1-4是纖溶酶原的降解片段并具有強大的抑制新生血管形成作用，可特異地抑制處于增殖狀態(tài)的血管內(nèi)皮細胞并誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的凋亡，來發(fā)揮強大的抑制新生血管的作用，并且不影響靜止的內(nèi)皮細胞。

多項腫瘤研究報告證明，腫瘤的轉(zhuǎn)移和生長依賴于血管的形成，因此抗血管新生成為抗腫瘤的一種最為重要的治療手段。血管抑素于1994年被0Reilly等發(fā)現(xiàn)血以來，它以高效的抗新生血管生成作用且無耐藥性等特點而倍受關(guān)注，是當(dāng)前已知最為有效的血管生成抑制劑。本實驗通過證明血管抑素是以抑制血管內(nèi)皮細胞增生達到抑制血管形成，從而阻斷角膜新生血管的形成，且能有效的促進已形成的新生血管萎縮。同時也證明了新生血管的內(nèi)皮細胞是血管抑素作用的直接靶點之一，對其他細胞及正常狀態(tài)下的血管內(nèi)皮細胞未見明顯抑制作用。

MTT實驗結(jié)果顯示血管抑素能顯著抑制內(nèi)皮細胞的生長，隨著血管抑素濃度的增加其抑制作用亦顯著增加：當(dāng)血管抑素質(zhì)量濃度逐漸加大時，隨著作用時間的延長對其抑制作用也逐漸增強，具有劑量一時間的雙重依賴性。國內(nèi)外研究均證明了VEGF在血管新生過程起重要作用，抑制了VEGF的表達即可抑制新生血管的形成；實時熒光定量PeR結(jié)果顯示，對照組與A組中的VEGF-mRNA的表達存在顯著差異；對照組與B組比較存在顯著差異，A組與B組比較存在顯著差異。同時也顯示、與空白對照組比較A、B組VEGF mRNA的表達分別下降了約40％、73％。證明了血管抑素抑制新生血管是通過抑制VEGF的表達。Western blot結(jié)果再次證明血管抑素作用人臍靜脈內(nèi)皮細胞后，VEGF蛋白表達的改變，隨著血管抑素濃度的增加和時間延長而減少。

角膜新生血管的生長亦是通過血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移等方式實現(xiàn)血管新生。血管抑素通過作用VEGF靶點在體外細胞培養(yǎng)過程中顯示了強大的抗血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移等作用，從而抑制了新生血管的延長、甚至引起已形成的新生血管萎縮、退化。上述實驗為血管抑素在治療眼科角膜新生血管提供有力的支持。為下一步的動物實驗及臨床實驗打下基礎(chǔ)。