蔡永明 張春云 申文晉 李 銘 姜 凌 張宗鵬*

(1.天津藥物研究院天津市新藥安全評價研究中心，天津 300301;2.天津中醫(yī)藥大學研究生院藥物分析學專業(yè)，天津 300193;3.天津藥物研究院釋藥技術(shù)與藥代動力學國家重點實驗室，天津 300193)

重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(recombi-nant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，rhGM-CSF)作用于造血祖細胞，促進其增生和分化［1］，增強單核細胞抗原遞呈能力［2］，提高粒細胞和單核細胞抗體依賴細胞的細胞毒［3］。rhGM-CSF臨床用于治療腫瘤病人因放射治療或化學治療引起的白細胞減少癥［4］;單獨或與抗真菌藥聯(lián)合使用可增強抗菌作用［5］;具有提高免疫、抗炎和促進創(chuàng)面愈合功能［6-7］。rhGM-CSF栓經(jīng)陰道局部給藥，擬治療宮頸糜爛。為非臨床安全性評價的確切性提供依據(jù)，本課題組進行了大鼠和Beagle犬的免疫原性試驗。

1 材料和方法

1.1 試驗藥物

重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子栓，長春金賽藥業(yè)股份有限公司提供。規(guī)格:①1.5 g/栓(藥物含量分別為0、0.87、3.46 和13.84 mg/g)，批號20060401，用于大鼠給藥;②8.0 g/栓(藥物含量分別為0、0.7、2.8和11.2 mg/g)，批號:20060510，用于 Beagle犬給藥。4℃保存。

1.2 檢測抗rhGM-CSF抗體的試劑

包被抗原為rhGM-CSF(HPLC純度:99.4%，濃度:1 mg/mL，批號:CG20050901)長春金賽藥業(yè)股份責任公司提供。大鼠免疫球蛋白(immunoglobulin G，IgG)和犬IgG由軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所提供。辣根過氧化物酶標記的羊抗大鼠IgG，美國SBA公司產(chǎn)品;辣根過氧化物酶標記的羊抗犬IgG，美國Rockland Immunochemicals公司產(chǎn)品。酶反應(yīng)底物3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB)和噻唑藍(MTT)為Sigma產(chǎn)品。TF-1(人紅白血病細胞)由中國藥品生物制品檢定所提供。RPMI 1640培養(yǎng)液為美國Gibco產(chǎn)品。96孔酶標板和細胞培養(yǎng)板，均為美國Costar產(chǎn)品。

1.3 試驗用主要儀器

550型酶標微板讀數(shù)儀，美國Bio-red公司產(chǎn)品。Columbus洗板機，奧地利TECAN公司產(chǎn)品。Thermo Scientific Sorvall ST 16R低溫離心機，美國Thermo公司產(chǎn)品。DKB-501A型恒溫水槽，上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.4 實驗動物

①雌性SD大鼠(試驗開始體質(zhì)量125～145 g)20只，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物許可證號:SCXK(京)2002－0003，飼養(yǎng)環(huán)境為屏障系統(tǒng)。②雌性Beagle犬(6～8 kg)24只，安徽阜陽市維光實驗動物中心提供，實驗動物許可證號:SCXK(皖)06－001，全封閉觀察室，單籠飼養(yǎng)。本試驗在優(yōu)良規(guī)范(good laboratory practice，GLP)實驗室完成。

1.5 受檢血清樣本

1.5.1 大鼠血清

rhGM-CSF栓大鼠長期毒性試驗設(shè)0(賦形劑對照組)、0.24、0.96及3.84 mg/kg 4個組，本試驗是對長期毒性試驗中每組的5只大鼠定期跟蹤監(jiān)測抗體，包括給藥1、2、3個月和恢復1個月血清樣本。大鼠眼靜脈叢取血約0.8 mL，制備血清，－20℃保存。

1.5.2 Beagle犬血清

rhGM-CSF栓Beagle犬長期毒性試驗設(shè)0(賦形劑對照組)、rhGM-CSF栓 0.07、0.28和1.12 mg/kg 4個組，每組6只動物。于給藥前、給藥期1個月、3個月及恢復期1個月從前肢隱靜脈采血約2 mL，制備血清，－20℃保存。

1.6 間接ELISA法測定抗rhGM-CSF抗體

將rhGM-CSF(抗原)用 pH 9.6的 Na2CO3-NaHCO3溶液稀釋成10 μg/mL濃度，包被于96孔酶標板上，每孔100 μL，4℃過夜。用2% 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉液37℃封閉2 h后，各孔加入100 μL經(jīng)10倍系列稀釋的待檢血清樣品;同時設(shè)陽性和陰性對照孔，37℃孵育1 h。洗滌后每孔加100 μL辣根過氧化物酶標記的羊抗大鼠IgG(1:10萬)或羊抗犬IgG(1:30萬)，37℃再孵育1 h。洗滌后各孔加100 μL酶反應(yīng)底物TMB，37℃反應(yīng)20～25 min。用2 mol/L硫酸50 μL終止反應(yīng)，在酶標微板讀數(shù)儀上讀取各孔450 nm處的吸光值。

1.7 體外測活法鑒定抗體的中和活性

采用TF-1細胞(人紅白血病細胞)/MTT(噻唑藍)比色法檢測抗體的中和活性。TF-1細胞系為rh-GM-CSF依賴型細胞，只有在rhGM-CSF存在情況下才可存活，若血清產(chǎn)生抗rhGM-CSF的中和抗體，中和了rhGM-CSF活性，則TF-1細胞不能存活。據(jù)此原理檢測血清產(chǎn)生抗rhGM-CSF抗體的中和活性。在96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔分別加入用基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋濃度至2 ng/mL rhGM-CSF(50 μL)，分別取經(jīng)系列稀釋后的血清樣品50 μL，加入上述含有2 ng/mL rhGMCSF 96孔板培養(yǎng)板中，振蕩混合，37℃，作用1 h。然后各孔加入50 μL TF-1細胞懸液(4.0×105/mL)，37℃，5%CO2培養(yǎng) 40～48 h。每孔再加入 20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后加入100 μL裂解液，混勻后，在酶標微板讀數(shù)儀上讀取各孔570 nm處的吸光度(參比波長為630 nm)。

1.8 陽性結(jié)果的判斷標準及統(tǒng)計學方法

以同期賦形劑對照組動物血清標本所測得吸光值的2.1倍作為產(chǎn)生抗體的閾值，凡給藥后血清標本測得的吸光值大于或等于閾值者，判定為陽性。各劑量組動物血清中所測的結(jié)合抗體和中和抗體的試驗數(shù)據(jù)均以抗體滴度對數(shù)的均數(shù)±標準差()表示，滿足正態(tài)性分布數(shù)據(jù)用單因素方差分析法進行組間比較，同時進行方差齊性檢驗(若方差齊性，用LSD法;方差不齊性，用Tamhane's T2法)。不滿足正態(tài)性的數(shù)據(jù)用非參數(shù)檢驗中的多組秩和檢驗(Kruskal-Wallis H法)。計數(shù)資料采用交叉表χ2檢驗，F(xiàn)isher單側(cè)精確檢驗(總頻數(shù)N＜40)。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 ELISA法檢測結(jié)果

2.1.1 大鼠血清樣本測定結(jié)果

抗體監(jiān)測試驗結(jié)果表明，在大鼠重復陰道給予rhGM-CSF栓3個月的長期毒性試驗中，從給藥1個月(以下簡稱M1)起一直持續(xù)到恢復期結(jié)束(以下簡稱rM1)，0.24、0.96和3.84 mg/kg 3個劑量組動物血清中均能檢測到抗rhGM-CSF的抗體。在給藥2個月(以下簡稱M2)后抗體強度有逐漸增強的趨勢，并在給藥期3個月(以下簡稱M3)至恢復期內(nèi)抗體強度變化不大。在給藥的第1個月和第2個月時，高劑量組動物血清所檢測到的抗體滴度明顯高于低劑量組和中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，低、中劑量組差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)果詳見表1、表2和圖1。

表1 大鼠重復陰道給予rhGM-CSF栓后產(chǎn)生抗體的動物比例(產(chǎn)生抗體動物數(shù)/總動物數(shù))Tab.1 The incidence of anti-rhGM-CSF antibodies in rats vaginally administered rhGM-CSF suppository(ratio of positive to total animals)

表2 ELISA法測定大鼠重復陰道給予rhGM-CSF栓后抗rhGM-CSF結(jié)合抗體的形成Tab.2 The titer of anti-rhGM-CSF binding antibodies in the sera of the rats were determined during the treatment and recovery periods by ELISA method (，n=5)

表2 ELISA法測定大鼠重復陰道給予rhGM-CSF栓后抗rhGM-CSF結(jié)合抗體的形成Tab.2 The titer of anti-rhGM-CSF binding antibodies in the sera of the rats were determined during the treatment and recovery periods by ELISA method (，n=5)

*P ＜0.05 vs group of 3.84 mg/kg;M1:treated with rhGM-CSF for one month;M2:treated with rhGM-CSF for two months;M3:treated with rhGM-CSF for three months;rM1:recovery period for one month;rhGMCSF:recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.

Doses(mg·kg_－1)_____________Log titer of treatment M1 M2 M3____Log titer of recovery rM1 0————0.24 2.00 ±0.00* 2.60 ±0.55 2.60 ±0.55 2.40 ±0.89 0.96 1.80 ±0.84* 2.20 ±1.10*2.40 ±0.89 2.60 ±0.55___3.84______3.00 ±0.00____3.60 ±0.55___3.40 ±0.8____________9_3.00±0.00

圖1 ELISA法測定大鼠陰道給藥血清中產(chǎn)生抗rhGM-CSF結(jié)合抗體滴度(，n=5)Fig.1 The titer of anti-rhGM-CSF binding antibodies in the sera of the rats were determined during the treatment and recovery periods using ELISA(，n=5)

2.1.2 Beagle犬血清樣本測定結(jié)果

Beagle犬各劑量組在給藥前、給藥后1個月和3個月(停藥次日)及恢復期1個月，各劑量組動物血清采用ELISA方法所測得的吸光值均低于同期賦形劑對照組抗體的閾值，表明血清中沒有檢測到抗rhGMCSF的結(jié)合抗體。

2.2 中和抗體檢測結(jié)果

對采用ELISA方法檢測出產(chǎn)生結(jié)合抗體的血清樣品，進行抗體中和活性測定，以觀察所產(chǎn)生的結(jié)合抗體是否為中和抗體。體外活性測定結(jié)果顯示，各劑量組在給藥1個月開始就有部分動物產(chǎn)生中和抗體;高劑量組在給藥2個月開始全部動物都產(chǎn)生中和抗體，一直持續(xù)到恢復期結(jié)束，中和活性滴度(滴度的對數(shù))在1.80～2.05間(滴度的對數(shù));低、中劑量組則在恢復期結(jié)束才全部產(chǎn)生中和抗體;恢復期結(jié)束三個劑量組中和抗體滴度(滴度的對數(shù))范圍在1.02～2.05間。結(jié)果詳見表3、表4和圖2。

表3 大鼠重復陰道給予rhGM-CSF栓血清中產(chǎn)生中和抗體的比例(產(chǎn)生中和抗體動物數(shù)/總動物數(shù))Tab.3 The incidence of neutralizing antibodies in rats vaginally administered rhGM-CSF suppository(ratio of positive to total animals)

M1:treated with rhGM-CSF for one month;M2:treated with rhGMCSF for two months;M3:treated with rhGM-CSF for three months;rM1:recovery period for one month;rhGM-CSF:recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.

表4 rhGM-CSF栓大鼠給藥不同時期血清中抗體的中和活性滴度Tab.4 The titer of neutralizing antibodies in the sera of the rats were determined during the treatment and recovery periods(，n=5)

表4 rhGM-CSF栓大鼠給藥不同時期血清中抗體的中和活性滴度Tab.4 The titer of neutralizing antibodies in the sera of the rats were determined during the treatment and recovery periods(，n=5)

*P ＜0.05 vs group of 0.96 mg/kg;#:P ＜0.05 vs group of vs 0.24 mg/kg;M1:treated with rhGM-CSF for one month;M2:treated with rh-GM-CSF for two months;M3:treated with rhGM-CSF for three months;rM1:recovery period for one month;rhGM-CSF:recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.

Doses/(mg·kg_－1)Log titer of treatment M1 M2 M3 Log titer of recovery rM1 0 0 0 0 0 0.24 0.421 ±0.404 1.806 ±1.021 1.445 ±0.252 1.024 ±0.457 0.96 0.120 ±0.269 0.843 ±0.779 0.843 ±0.779 1.626 ±0.269#_3.84___0.602 ±0.476 2.047 ±0.495*1.806 ±0.476*2.047 ±0.5__38#

圖2 rhGM-CSF栓大鼠給藥不同時期血清中和抗體滴度Fig.2 The titer of neutralizing antibodies in the sera of the rats were determined during the treatment and recovery periods using bioassay method(，n=5)

3 討論

rhGM-CSF是一種基因工程藥物，其主要作用是刺激粒細胞和單核巨噬細胞的成熟，促進成熟細胞向外周血釋放［8］，rhGM-CSF可增加機體免疫力，對抗炎性反應(yīng)［9］。rhGM-CSF作為重組蛋白或多肽類生物技術(shù)藥物對非同源的動物而言具有免疫原性，所產(chǎn)生的抗體是否有中和活性視藥物和動物而異［10］。在重復給藥的毒性試驗中，如果出現(xiàn)具有中和活性的抗體會減弱藥物的藥理作用，干擾毒性反應(yīng);而抗原抗體復合物的產(chǎn)生又可能會出現(xiàn)新的毒性反應(yīng)［11-12］。因此監(jiān)測抗體的產(chǎn)生和中和活性的強弱十分重要。大鼠重復陰道給予rhGM-CSF栓3個月的試驗中，血清中能檢測到抗rhGM-CSF的抗體，并且所檢測到的抗體具有中和活性，表明rhGM-CSF對大鼠具有較強的免疫原性。該免疫原性會減弱藥物的活性以及與活性相關(guān)的毒性，可能會影響rhGM-CSF毒性的判斷。所產(chǎn)生的抗原抗體免疫復合物是否會在腎臟產(chǎn)生沉積，宜進一步用免疫組化方法來證實［13］。在Beagle犬體內(nèi)未檢測到抗rhGM-CSF的抗體產(chǎn)生，采用Beagle犬作為實驗動物模型進行長期毒性試驗以評價rhGMCSF栓重復給藥毒性，會更能反映藥物毒性暴露，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

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