潘惠艷 趙 群 詹 陽 趙麗紅 張衛(wèi)華 吳玉梅

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100026;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科，北京 100026;3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院病理科，北京 100026)

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，侵襲和轉(zhuǎn)移是影響宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。電壓門控鈉通道(voltage-gated sodium channels，VGSC)蛋白家族由九個成員組成，分別命名為Nav1.1～Nav1.9，其主要分布于神經(jīng)、肌肉和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，負(fù)責(zé)細(xì)胞膜的興奮和傳播動作電位［1］。近年來，研究顯示［2-3］VGSC在一些轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞中表達(dá)，如Nav1.5亞型在乳腺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)，Nav1.7亞型主要在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)，其與癌細(xì)胞的遷移和侵襲呈正相關(guān)。目前，國內(nèi)外對VGSC在宮頸癌細(xì)胞中的研究較少，已發(fā)現(xiàn)在宮頸癌原代培養(yǎng)細(xì)胞中檢測到VGSC電流，scn8a基因編碼的產(chǎn)物Nav1.6亞型特異性阻止劑可抑制其電流，亦抑制細(xì)胞的侵襲［4］。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院的前期研究［5］提示宮頸癌SiHa細(xì)胞株表達(dá)VGSC蛋白，但其表達(dá)亞型和作用仍不清楚。本研究采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)，使用針對scn8a基因小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染宮頸癌SiHa細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞增生、遷移和侵襲的影響，探討VGSC在宮頸癌細(xì)胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1)細(xì)胞株:人宮頸癌細(xì)胞株SiHa細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

2)試劑:10%胎牛血清和DMEM培養(yǎng)液(美國Gibico公司);5'－熒光素氨基磷酸酯-siRNA(6-FAM-siRNA，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成);Trizol和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司);RTPCR試劑盒(美國Promega公司);兔抗人Nav1.6多克隆抗體(以色列Alomone labs公司);抗β－肌動蛋白(β-actin)抗體(美國Sigma公司);Matrigel膠(美國BD公司)。

3)儀器和耗材:M450酶標(biāo)儀(美國 Bio-Rad公司);FS-919PCR擴(kuò)增儀(中國上海復(fù)生生物研究所產(chǎn));細(xì)胞培養(yǎng)皿(美國Coring Costar公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);Transwell小室(美國 Coring Costar公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人宮頸癌SiHa細(xì)胞孵育于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱及含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化傳代。將SiHa細(xì)胞以5×105個/孔接種于6孔板培養(yǎng)48 h后，利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將體外合成的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。每次實(shí)驗(yàn)分為4個組:空白對照組(未轉(zhuǎn)染組)、脂質(zhì)體組(Lipo對照組)、轉(zhuǎn)染陰性對照(negative control，NC)組和scn8a RNAi轉(zhuǎn)染組。參考來自GenBank的scn8a基因序列(序列號:374429548)，由上海吉瑪公司設(shè)計合成siRNA寡聚核苷酸片段序列為5'-CCCAGUUCAUUGAGUACUGUA-3'(靶點(diǎn)為721～739 bp)。合成的陰性對照siRNA序列的有意義鏈分別為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUAA-3'，此順序與人類基因無同源性。

1.3 總RNA提取及RT-PCR

采用半定量RT-PCR法檢測scn8a mRNA的表達(dá)水平。SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，取總RNA 1μg，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再進(jìn)行半定量RT-PCR反應(yīng)。目的基因scn8a的引物序列:上游引物5'-AGACCATCCGCACCATCCTG-3'，下游引物 5'-GGTCAACGGTATGTAGTGC-3'，擴(kuò)增片段為517 bp。以 β-actin為內(nèi)對照，擴(kuò)增片段為268 bp。PCR反應(yīng)條件為:95℃ 3 min后，94℃ 30 s，60℃30 s，72 ℃ 30 s，設(shè)定36 個循環(huán)。在擴(kuò)增24、28、32 和36個循環(huán)時，取3μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，結(jié)果用溴化乙錠染色后紫外照相并進(jìn)行掃描分析，以scn8a和 β-actin條帶的吸光度值進(jìn)行 scn8a mRNA表達(dá)水平定量分析，scn8a mRNA的相對含量=scn8a條帶光密度吸光度值/β-actin條帶的吸光度。

1.4 Western blotting

SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，每泳道以50 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行6%SDS-PAGE凝膠電泳，恒壓100 mV電泳2 h后，恒流250 mA轉(zhuǎn)膜4 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，用兔抗鼠Nav1.6多克隆抗體(1:500)于4℃培育過夜，TBST漂洗3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5 000)，37℃搖床溫育2 h，經(jīng)ECL系統(tǒng)曝光顯影，通過凝膠分析系統(tǒng)分析蛋白的表達(dá)。β-actin為內(nèi)對照。Nav1.6蛋白的相對含量=Nav1.6蛋白條帶吸光度值/β-actin(內(nèi)對照)條帶吸光度值。

1.5 MTT法測定細(xì)胞增生實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞48 h，收集各組細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞后，以每孔1×105/mL的密度接種于96孔板中，再培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT(5 mg/mL)試劑，37℃孵育4 h，加入150 μL/孔的二甲基亞砜溶液，在酶標(biāo)儀測定492 nm波長處各孔的吸光度值。各組細(xì)胞增生抑制率=［(對照組吸光值－實(shí)驗(yàn)組吸光值)/對照組吸光值］×100%。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力

SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，收集各組細(xì)胞。PBS洗滌細(xì)胞后，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，按8×105個/孔的密度接種到6孔板培養(yǎng)24 h后，吸掉培養(yǎng)液，用10 μL洗液尖(Tip頭)沿著培養(yǎng)板底部劃“一”字形劃痕，PBS洗去未貼壁細(xì)胞，拍照記錄，并在劃痕每側(cè)邊緣均勻選取30個點(diǎn)后取其中線代表劃痕邊緣，在帶有標(biāo)尺的倒置顯微鏡下測量細(xì)胞劃痕間距，記錄間距(0 h)。劃痕后24 h，細(xì)胞換液，在48 h，同法在每側(cè)邊緣均勻選取30個點(diǎn)后取其中線代表劃痕邊緣，記錄間距(48 h)。細(xì)胞遷移距離=間距(0 h)－間距(48 h)。

1.7 Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)

在12孔板Transwell上室加入1 g/L的Matrigel膠50 μL，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜。膠凝固后，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液500 μL。SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，每組細(xì)胞以2 ×105個/孔置于200 μL懸液(含1%胎牛血清的DMEM)加入Transwell上室，置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，取出上室，下室以95%乙醇固定15 min，HE法染色，計數(shù)侵入下室的細(xì)胞。計數(shù)時取中央和四周各5個視野，計算平均值。細(xì)胞的侵襲指數(shù)/%=(下室細(xì)胞數(shù)/上室接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，用單因素方差分析及均數(shù)多重比較。兩樣本均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA的轉(zhuǎn)染率及對scn8a mRNA和Nav1.6蛋白表達(dá)水平的影響

以6-FAM熒光標(biāo)記的陰性對照RNA及特異siRNA轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞6 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，均可見達(dá)90%左右，詳見圖1A。

圖1 siRNA轉(zhuǎn)染效率及其對scn8a mRNA和Nav1.6蛋白表達(dá)水平的影響Fig.1 Transfection efficiency and the expression of mRNA and Nav1.6 protein after RNAi targeting scn8a

為了解siRNA對SiHa細(xì)胞scn8a mRNA水平的影響，轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，提取各組細(xì)胞RNA，半定量RTPCR結(jié)果顯示(圖1B)，RNAi組scn8a mRNA相對值為(23.3±4.2)%，明顯低于未轉(zhuǎn)染組(62.5±3.6)%、Li-Po組(59.6±5.0)%和陰性 RNAi轉(zhuǎn)染組(58.0±3.5)%，與3者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。RNAi組較未轉(zhuǎn)染組scn8a mRNA水平降低(62.7±5.8)%(P＜0.05)，而LiPo組和陰性RNAi轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.291)。

在SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，使用Western blotting檢測各組Nav1.6蛋白水平(圖1C)，結(jié)果顯示RNAi組Nav1.6蛋白相對值為(18.6±3.8)%，表達(dá)水平明顯低于未轉(zhuǎn)染組(54.3±6.4)%、LiPo組(50.7±5.1)%和陰性RNAi轉(zhuǎn)染組(52.5±4.6)%。RNAi組較未轉(zhuǎn)染組Nav1.6蛋白表達(dá)降低(65.8±5.8)%(t=3.17，P ＜0.05)，LiPo組和陰性 RNAi轉(zhuǎn)染組分別與未轉(zhuǎn)染組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 scn8a的 RNAi對宮頸癌 SiHa細(xì)胞的增生無影響

MTT法檢測結(jié)果顯示(表1)，SiHa細(xì)胞在siRNA轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞吸光度值(0.556±0.038)與未轉(zhuǎn)染組(0.545±0.043)、LiPo對照組(0.560±0.048)和陰性RNAi轉(zhuǎn)染組(0.549±0.036)吸光值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示Nav1.6活性未影響SiHa細(xì)胞的增生。

表1 siRNA抑制scn8a表達(dá)對SiHa細(xì)胞增生無影響Tab.1 siRNA targeting scn8a had no effect on proliferation of cervical cancer SiHa cells

2.3 scn8a的RNAi降低宮頸癌 SiHa細(xì)胞的遷移能力

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2)，RNAi組24 h細(xì)胞的遷移距離(0.28±0.04)mm明顯小于未轉(zhuǎn)染組(0.63±0.06)mm、LiPo組(0.58±0.05)mm和陰性RNAi轉(zhuǎn)染組(0.61±0.04)mm，與3者分別進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。RNAi組較未轉(zhuǎn)染組遷移距離降低55.6%(t=3.68，P＜0.05)，而LiPo組和陰性RNAi轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.213)。

圖2 劃痕48 h后，SiHa細(xì)胞的遷移結(jié)果Fig.2 The‘wound’images at 48 h after initial‘wound’(100 ×)

2.4 scn8a的 RNAi抑制宮頸癌 SiHa細(xì)胞的侵襲能力

Magrigel侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖3)，RNAi組SiHa細(xì)胞的侵襲指數(shù)(8.2±2.4)%明顯低于未轉(zhuǎn)染組(13.0±1.8)%、LiPo組(13.3±2.0)%和陰性RNAi轉(zhuǎn)染組(13.6±1.6)%，RNAi組與其余3者進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.98，P＜0.05)。RNAi組細(xì)胞侵襲較空白對照組降低36.9%(t=2.98，P＜0.05)，LiPo組和陰性 RNAi轉(zhuǎn)染組分別與未轉(zhuǎn)染組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

圖3 針對scn8a基因siRNA降低SiHa細(xì)胞的侵襲能力Fig.3 Transfection of siRNA targeting scn8a gene supressed the Matrigel invasion of cervical cancer SiHa cells.

VGSC是“可興奮”細(xì)胞膜上的跨膜糖蛋白，依賴細(xì)胞膜上電壓變化而激活。VGSC家族由九個成員組成，其中Nav1.6和Nav1.7主要表達(dá)于外周神經(jīng)，Nav1.5主要表達(dá)于心肌，Nav1.4主要表達(dá)于骨骼肌，其他亞型分別表達(dá)于外周和中樞神經(jīng)細(xì)胞［6］。有報道［7］，scn8a基因突變常會導(dǎo)致肌張力障礙、震顫、共濟(jì)失調(diào)等異常，其他亞型的異?？梢鸢d癇、慢性疼痛綜合征、阿爾茨海默病(Alzheimer)等疾病。隨著近年來對腫瘤研究的深入，有報道［2-3］顯示VGSC在乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌等細(xì)胞中表達(dá)，其涉及腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。RNAi技術(shù)是mRNA水平上沉默特定基因的一種較新方法，能夠抑制內(nèi)源性或外源性基因的表達(dá)，具有穩(wěn)定性高、快捷、高效特異等優(yōu)點(diǎn)，已成為腫瘤研究中的理想工具。

本研究采用RNAi技術(shù)沉默宮頸癌SiHa細(xì)胞scn8a基因表達(dá)，觀察到細(xì)胞可有效轉(zhuǎn)染并明顯抑制scn8a mRNA及其蛋白Nav1.6水平，表明實(shí)驗(yàn)所用的RNAi干擾序列特異性地抑制scn8a表達(dá)。在觀察RNAi沉默scn8a基因表達(dá)后細(xì)胞的增生變化時，未觀察到其對SiHa細(xì)胞增生有顯著影響。此結(jié)果與本課題組前期在宮頸癌ME180細(xì)胞的研究結(jié)果［5］相一致，VGSC阻滯劑海豚毒素(tetrodotoxin，TTX)對ME180細(xì)胞的增生無明顯影響，這亦提示Nav1.6活性未涉及宮頸癌細(xì)胞的增生。目前對VGSC涉及腫瘤細(xì)胞增生有不同報道，有報道［8］顯示Na+內(nèi)流促進(jìn)癌細(xì)胞的增生，如瞬間Na+內(nèi)流發(fā)生于增生早期，控制外在Na+濃度可有效抑制細(xì)胞增生［8］。在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞檢測到 Nav1.5和 Nav1.7亞型，其中RNAi抑制Nav1.5表達(dá)可抑制細(xì)胞增生［9］。然而，在高轉(zhuǎn)移潛能的前列腺癌Mat-Lylu細(xì)胞和乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞，TTX對細(xì)胞增生無作用，即VGSC活性不涉及癌細(xì)胞的增生［10-11］。這些差異可能是由于細(xì)胞類型不同所導(dǎo)致。

本研究顯示，RNAi沉默宮頸癌SiHa細(xì)胞scn8a基因表達(dá)后，細(xì)胞的遷移和Matrigel侵襲明顯下降，這說明Nav1.6表達(dá)參與宮頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。有報道［12-13］顯示小鼠前列腺癌Mat-Lylu細(xì)胞和人前列腺癌PC-3細(xì)胞主要表達(dá)Nav1.7亞型，VGSC阻斷劑TTX分別抑制細(xì)胞遷移達(dá)47%和61%，抑制細(xì)胞Matrigel侵襲達(dá)33%和42%。乳腺癌高轉(zhuǎn)移潛能的MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)Nav1.5亞型，TTX抑制細(xì)胞的遷移Matrigel侵襲分別為52%和49%［11］。House C D等［3］報道在結(jié)腸癌 HT29、SW620和 SW480細(xì)胞中檢測到Nav1.5亞型，針對scn5a基因RNAi和鈉離子通道阻滯劑TTX均抑制細(xì)胞Matrigel侵襲超過50%。在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，RNAi阻止Nav1.7表達(dá)可抑制細(xì)胞的趨向運(yùn)動［9］。這些結(jié)果支持目前在宮頸癌SiHa細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)，即VGSC Nav1.6亞型涉及細(xì)胞的遷移和侵襲。

目前對VGSC參與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍不清楚，考慮有以下兩個方面［14-15］:①VGSC表達(dá)可引起細(xì)胞內(nèi)Na+濃度增加，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變，其中包括 Ca2+濃度增加［16］(Na+/Ca2+交換增多)、pH發(fā)生變化［17］(Na+/H+交換增多，H+-ATP酶活性增加)以及Na+依賴的酶(蛋白激酶A、組織蛋白酶等)激活［18］，其可引起癌細(xì)胞遷移、侵襲和分泌等細(xì)胞行為的改變，涉及到癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。②VGSC由α或β亞單位組成，其均可與細(xì)胞膜/或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白結(jié)合［19］，其中包括細(xì)胞骨架蛋白錨蛋白(ankyrin)，黏附分子等［20］，最終影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，VGSC Nav1.6亞型在宮頸癌SiHa細(xì)胞中表達(dá)，利用siRNA可有效抑制scn8a表達(dá)，進(jìn)而抑制SiHa細(xì)胞的遷移和侵襲能力，這對于開發(fā)和利用scn8a基因作為治療宮頸癌轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)提供了新的思路。

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