王生銀，馬 清，王鎖民

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州 730020)

鹽害是導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)的主要非生物因素之一[1-2]，土壤中高濃度的Na+會(huì)擾亂植物正常的代謝活動(dòng)，影響根系對(duì)K+和其他必需元素的吸收，產(chǎn)生滲透脅迫并誘發(fā)氧化脅迫等次生脅迫，從而導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受到抑制，甚至死亡[3-4]。鹽生植物在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中，形成了其特殊的耐鹽機(jī)制。對(duì)其耐鹽機(jī)理的研究以及耐鹽功能基因的挖掘在農(nóng)作物和優(yōu)良牧草耐鹽性的遺傳改良方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值。

鹽地堿蓬(Suaedasalsa)又名鹽蓬、蓬子菜和鹽蒿，屬藜科堿蓬屬一年生多汁草本鹽生植物，生于鹽漬化土壤、湖濱、河岸和沿海地帶，可在400 mmol·L-1的鹽濃度下完成其生活史[5]，是典型的鹽堿地指示植物[6]，也是研究植物耐鹽機(jī)制極好的基因庫(kù)[7-8]。鹽地堿蓬能夠在含鹽量很高的土壤中正常生長(zhǎng)，原因在于其根系吸收的Na+能夠有效地運(yùn)輸?shù)街仓甑厣喜坎?chǔ)存在液泡中，從而降低植株地上部的水勢(shì)，提高植株的吸水能力，同時(shí)也避免了離子在細(xì)胞質(zhì)中過多積累而擾亂植物正常生理生化代謝活動(dòng)[9-10]。然而，有關(guān)Na+從鹽地堿蓬根部向地上部運(yùn)輸機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。近來研究表明，參與Na+從細(xì)胞中外排的質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (SOS1) 可能參與此過程[11-13]。

質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性首先在大麥(Hordeumvulgare)中發(fā)現(xiàn)，并確定其主要與Na+的外排有關(guān)[14]，是植物抗拒鹽離子毒害的首個(gè)屏障，質(zhì)膜 H+-ATPase為其提供能量[15-16]。隨后相繼從擬南芥(Arabidopsisthaliana)[4,16-18]、水稻(Oryzasativa)[18]、小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)[19]等植物中克隆了編碼質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，并確定其參與植物根部Na+的外排[20-22]。然而，Shi等[17]發(fā)現(xiàn)，在輕度鹽脅迫(25 mmol·L-1NaCl)下，擬南芥質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (AtSOS1) 的功能是將Na+裝載進(jìn)入根木質(zhì)部，以便于Na+向植株地上部轉(zhuǎn)移并最終存貯在葉肉細(xì)胞的液泡中；而在重度鹽脅迫(100 mmol·L-1NaCl)下，AtSOS1的功能可能是從根的木質(zhì)部中卸載Na+，從而在鹽脅迫下調(diào)節(jié)Na+通過木質(zhì)部向植株地上部的運(yùn)輸，減輕過多的 Na+對(duì)葉的傷害。Olías等[12-13]研究表明，在鹽脅迫下，番茄(Solanumlycopersicum)質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SlSOS1)可能通過控制Na+的長(zhǎng)距離運(yùn)輸來調(diào)控Na+在植物體不同器官中的分布，使Na+大量積累在莖中，從而保護(hù)根及重要的光合器官免受Na+毒害。然而，目前對(duì)SOS1的研究主要集中在模式植物和甜土植物上，對(duì)于鹽生植物SOS1的研究相對(duì)較少，特別是對(duì)積鹽型鹽生植物的研究尚未見報(bào)道。本研究采用 RT-PCR方法克隆積鹽型植物鹽地堿蓬的SOS1基因片段并分析其序列特征，以期為鹽地堿蓬SOS1全長(zhǎng)基因的克隆、表達(dá)調(diào)控等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 植物材料為4周齡鹽地堿蓬幼苗，種子采自內(nèi)蒙古自治區(qū)查干諾爾湖。大腸桿菌DH5α菌株在草類逆境生理與基因工程實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2研究方法

1.2.1材料培養(yǎng) 參照馬清等[23]的方法。挑選籽粒飽滿、無缺損、均勻一致的鹽地堿蓬種子，用蒸餾水沖洗2～3遍，在28 ℃下，經(jīng)蒸餾水浸種催芽24 h。待發(fā)芽后，移至滅菌的紅沙中，在溫室中澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行植物材料培養(yǎng)；Hoagland營(yíng)養(yǎng)液包括6 mmol·L-1KNO3、1 mmol·L-1NH4H2PO4、0.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O、0.5 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O、60 μmol·L-1Fe-citrate、92 μmol·L-1H3BO3、18 μmol·L-1MnCl2·4H2O、1.6 μmol·L-1ZnSO4·7H2O、0.6 μmol·L-1CuSO4·5H2O、0.7 μmol·L-1(NH4)6Mo7)24·4H2O；溫室的晝夜溫度為(28±2) ℃/(23±2) ℃，光照時(shí)間16 h·d-1，光照強(qiáng)度約600 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度60%～80%。

1.2.2總RNA的提取 取150 mmol·L-1NaCl處理48 h的4周齡鹽地堿蓬幼苗根系，加入液氮研磨至粉末狀，按照UNIQ-10 柱式Trizol總RNA抽提試劑盒的操作說明書提取根系總RNA。用1.0%甲醛變性凝膠電泳鑒定其完整性和質(zhì)量。

1.2.3引物的設(shè)計(jì)與合成 參照馬清等[24]的方法，通過對(duì)其他植物SOS1核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，找出高度保守的區(qū)段，根據(jù)同源性高和簡(jiǎn)并性低的原則，利用DNAMAN和Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物P1和P2，用于擴(kuò)增鹽地堿蓬SOS1基因片段，推測(cè)目的片段的長(zhǎng)度為736 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

P1：5’- GCATCA(C/T)TT(C/T)TGGGA(A/G)ATGGT -3’；

P2：5’- AT(C/T)CT(C/T/G)CC(C/T)TCATC(A/G)AGCAT -3’。

1.2.4RT-PCR擴(kuò)增 參照郭強(qiáng)等[24]的方法。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：在200 μL PCR管中依次加入10×PCR Buffer 5 μL、25 mmol·L-1MgCl23.5 μL、2 mmol·L-1dNTP 5 μL、10 μmol·L-1P11 μL、10 μmol·L-1P21 μL、Taq DNA polymerase (5 U·μL-1) 0.5 μL、cDNA 2 μL，加純水至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，目的片段的回收和純化按照UNIQ-10柱式DNA 膠回收試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.2.5陽性克隆的篩選與鑒定 參照郭強(qiáng)等[24]的方法。將回收的PCR產(chǎn)物連接到pUCm-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，用含有50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，轉(zhuǎn)化白斑菌株經(jīng)質(zhì)粒PCR鑒定確認(rèn)陽性克隆后，送至北京華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.2.6序列分析 序列的比較、翻譯等在DNAMAN生物軟件上進(jìn)行，Blast搜索在NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 網(wǎng)站上進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1RT-PCR擴(kuò)增 以鹽地堿蓬根系為材料提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的第一鏈cDNA為模板，用簡(jiǎn)并引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)約在736 bp處有1條亮帶，且上下無雜帶，與目的片段大小一致 (圖1)，推測(cè)可能是鹽地堿蓬SOS1基因片段。

2.2陽性克隆的鑒定 將回收純化的目的片段連接到pUCm-T克隆載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。從轉(zhuǎn)化的平板上隨機(jī)挑取2個(gè)白色菌斑并提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增片段大小約為736 bp(圖2)，與RT-PCR結(jié)果一致，表明這些克隆為陽性克隆。

2.3SOS1基因片段序列分析 測(cè)序結(jié)果顯示，該陽性克隆序列長(zhǎng)度為736 bp，推測(cè)其編碼244個(gè)氨基酸 (圖3)。Blast比較結(jié)果表明，該片段與海松菜(Suaedajaponica)、鹽角草(Salicorniabrachiata)、冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)和霸王(Zygophyllumxanthoxylum)等植物SOS1核苷酸序列的同源性均在74%以上，其中與海松菜SjSOS1(AB198179.1)核苷酸序列的同源性高達(dá)95%。表明本研究克隆到的片段為SOS1 基因片段，將其命名為SsSOS1。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

圖2 陽性克隆的PCR鑒定

圖3 鹽地堿蓬SsSOS1核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列

多重比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，鹽地堿蓬SsSOS1片段與藜科植物[如海松菜SjSOS1和鹽角草SbSOS1(EU879059.1)]的進(jìn)化關(guān)系非常近，氨基酸同源性分別高達(dá)98%和90%；與其他雙子葉植物如冰葉日中花McSOS1(AM746987.1)和霸王ZxSOS1(GU177864.1)的進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，同源性分別為77%和69%；而與單子葉植物如小花堿茅PtSOS1(GQ452778.1)的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)，同源性僅為61%(圖4、圖5)。此外，鹽地堿蓬SsSOS1氨基酸序列包含4個(gè)跨膜區(qū)，相對(duì)于非跨膜區(qū)而言，跨膜區(qū)則具有更高的同源性(圖4、圖5)。

3 討論

絕大多數(shù)高等植物的質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均由單基因編碼[16,18]。該蛋白N末端為一個(gè)疏水結(jié)構(gòu),主要負(fù)責(zé)Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)[16]，可能由10～12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域組成,不同物種間SOS1的高度同源區(qū)域主要位于該端。本研究克隆的SsSOS1片段位于其N末端，包含4個(gè)跨膜區(qū)，與其他植物SOS1核苷酸的同源性在74% 以上，編碼氨基酸的同源性在61%以上，相對(duì)于非跨膜區(qū)而言，跨膜區(qū)具有更高的同源性(圖4、圖5)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，本研究克隆的鹽地堿蓬SsSOS1片段與雙子葉黎科植物如海松菜SjSOS1和鹽角草SbSOS1的進(jìn)化關(guān)系最近，與其他雙子葉植物如冰葉日中花McSOS1和霸王ZxSOS1的進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，而與單子葉植物(如小花堿茅PtSOS1)的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)(圖5)?？梢姡煌参镔|(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在進(jìn)化上具有一定的差異，尤其是在單子葉和雙子葉植物之間，這種差異更明顯[23]。

圖4 SsSOS1氨基酸序列與其他植物SOS1氨基酸序列的多重比較

圖5 SsSOS1與其他植物SOS1的系統(tǒng)進(jìn)化樹

SOS1作為植物膜系統(tǒng)的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)Na+濃度的控制、pH值調(diào)節(jié)和細(xì)胞體積變化等一系列重要的生命活動(dòng)[25]。除上述功能外，SOS1在控制Na+長(zhǎng)距離運(yùn)輸方面起著非常重要的作用。Shi等[17]研究表明，在鹽脅迫下，擬南芥質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AtSOS1)可以調(diào)節(jié)Na+在木質(zhì)部中從根部向地上部的運(yùn)輸，減輕過多的Na+對(duì)葉造成的傷害。此外，SOS1在維持植物細(xì)胞K+穩(wěn)態(tài)平衡方面起著重要作用，其基因突變和表達(dá)下調(diào)均會(huì)影響植物K+吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的功能，進(jìn)而破壞細(xì)胞K+的穩(wěn)態(tài)平衡[26-27]。同時(shí)，SOS1也會(huì)影響植物細(xì)胞中Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)，其活性受抑制后，液泡膜上與Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的基因表達(dá)豐度顯著上調(diào)，致使液泡中積累大量的Ca2+[28]?？梢?，SOS1在植物耐鹽性方面具有非常重要的作用。本研究成功克隆了SsSOS1基因的核心片段，為SsSOS1全長(zhǎng)基因的克隆、表達(dá)調(diào)控及進(jìn)一步分析其在鹽地堿蓬Na+長(zhǎng)距離運(yùn)輸及K+、Ca2+穩(wěn)態(tài)平衡中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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