張靜華

云南省怒江州食品藥品檢驗(yàn)所，云南 怒江 673100

隨著食品藥品檢驗(yàn)所機(jī)構(gòu)的改革和職能的擴(kuò)充，我們將承擔(dān)食品的抽樣檢驗(yàn)工作。為了能夠順利開展食品檢測工作，我們做了一些相關(guān)的前期準(zhǔn)備工作。食品的衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)是食品質(zhì)量的重要組成部分，關(guān)系到人們的飲食安全。為了掌握現(xiàn)有的食品衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)方法是否能真實(shí)客觀地檢出食品中所污染的微生物。本文對15批飲料的微生物限度檢驗(yàn)方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 儀器、菌種、樣品與培養(yǎng)基

1.1 儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱 (101—2)，立式滅菌器(LMQC12360J)，生物安全柜 (BHC－1300ⅡA2)，潔凈工作臺 (SCW—CJ—2FD)，生化培養(yǎng)箱 (LRH—250F)，生化培養(yǎng)箱 (SPX—150)，電子天平 (SPS601F)。

1.2 菌種

大腸埃希菌 ［CMCC(B)44 102］，金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26 003］，枯草芽孢桿菌 ［CMCC(B)63 501］，白色念珠菌［CMCC(B)98 001］，乙型副傷寒沙門菌［CMCC(B)50094］。菌種均來自云南省食品藥品檢驗(yàn)所，為第Ⅲ代。

1.3 樣品

(1)C粒·檸檬汁 20110707 可口可樂裝瓶生產(chǎn)有限公司;

(2)30%混合果蔬汁 20110601 農(nóng)夫山泉股份有限公司;

(3)水晶葡萄汁 20110623 昆明頂津食品有限公司;

(4)白葡萄汁 20110530 昆明頂津食品有限公司;

(5)檸檬味運(yùn)動飲料 20110506 百事飲料 (廣州)有限公司;

(6)果繽紛混合果汁 20110428 百事飲料 (廣州)有限公司;

(7)芒果汁 20110816 重慶頂津食品有限公司;

(8)西柚汁 20110618 農(nóng)夫山泉股份有限公司;

(9)果繽紛混合果汁 20110508 百事飲料 (廣州)有限公司;

(10)芒果多 20110816 昆明統(tǒng)一企業(yè)食品有限公司;

(11)果味飲料 20110920 潞西市芒市爽爾康食品飲料廠;

(12)漾多酸角味飲料 20110624 大理漾濞多多飲料有限公司;

(13)仙怡果園酸角飲品 20110904 保山市仙怡飲料廠;(14)果味繽紛 20110907 隆陽區(qū)小聰郎食品廠;(15)花生露 20111007 云南大理市康禧樂食品廠。

1.4 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂 (110408)，營養(yǎng)肉湯 (100728)，膽鹽乳糖曾菌液 (110301)，玫瑰紅鈉瓊脂 (110526)，改良馬丁瓊脂 (100925)，改良馬丁瓊脂液體 (100624)，曙紅亞甲藍(lán)瓊脂 (110216)，葡糖糖肉浸液肉湯 (101910)，伊紅美蘭瓊脂 (110127)，麥康凱瓊脂 (110217)，沙門志賀菌屬瓊脂 (110321)，胰酪胨大豆肉湯 (110322)，卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基 (110121)，MUG(110301)，四硫酸鈉亮綠曾菌液 (110301)。以上培養(yǎng)基均來自宜興市永信生物有限公司。

2 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.1 菌液制備

2.1.1 將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，分別取上述各培養(yǎng)物1ml+9ml營養(yǎng)肉湯稀釋至10﹣5～10﹣7，使為50～100cfu/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。

2.1.2 將白色念珠菌接種于改良馬丁培養(yǎng)基，經(jīng)25℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，取培養(yǎng)物1ml+9ml改良馬丁培養(yǎng)基稀釋至10﹣5～10﹣7，使為50～100cfu/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。

2.1.3 取上述大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門菌10﹣5～10﹣7等稀釋液各1ml，用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿，平行測定兩皿，30～35℃培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)，選擇約50～100cfu/ml的稀釋級做試驗(yàn)菌液組菌液。

2.1.4 取白色念珠菌10﹣5～10﹣7稀釋液各1ml，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿，平行測定兩皿，23～28℃培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)，選擇約50～100cfu/ml的稀釋級做試驗(yàn)菌液組菌液。

2.2 供試液的制備

用原液作為常規(guī)法的供試液。稀釋法用0.1%蛋白胨氯化鈉90ml把原液10ml稀釋為1:10的供試液。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

2.3.1 菌液組，測定每一菌所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

2.3.2 試驗(yàn)組

2.3.2.1 常規(guī)法

取供試品原液1ml和50～100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。

2.3.2.2 培養(yǎng)基稀釋法

取0.5ml、0.2ml、0.1ml 1:10的供試液及50～100cfu試驗(yàn)菌分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。

2.3.3 供試品對照組

取供試品原液1ml注入2平皿，按菌落計(jì)數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。

2.3.4 回收率測定

按如下公式計(jì)算試驗(yàn)組的加菌回收率。

2.3.5 結(jié)果

2.3.5.1 先用常規(guī)法進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗(yàn)，各供試品對照組均無菌落生長。細(xì)菌于30～35℃培養(yǎng)3天，白色念珠菌于23～28℃培養(yǎng)5天，按平皿法計(jì)數(shù)，并計(jì)算試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率，結(jié)果見表1。

表1 常規(guī)法進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的回收率 (%)

2.3.5.2 通過常規(guī)法驗(yàn)證，第13號樣品3次試驗(yàn)，對金黃色葡萄球菌截稿的加菌回收率菌小于70%，于是對該批樣品的金黃色葡萄球菌項(xiàng)進(jìn)行培養(yǎng)基稀釋法驗(yàn)證。結(jié)果表明，0.2ml/皿供試液時(shí)，可消除該樣品對金黃色葡萄球菌的抑制作用。結(jié)果見表2。

表2 回收率小于70%的樣品采用培養(yǎng)基稀釋法0.2ml/皿的回收率 (%)

3 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

3.1 菌懸液的制備同2.1。

3.2 驗(yàn)證方法

按照《中國藥典》(2010年版一部附錄ⅧC)，取規(guī)定量供試液和試驗(yàn)菌液，采用直接接種法對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果均檢出試驗(yàn)菌，說明可以采用直接接種法進(jìn)行控制菌檢查。

4 結(jié)論

對15批飲料進(jìn)行了微生物限度檢查的方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果有14個批次可采用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢驗(yàn)，有1個批次有抑菌性，需用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行微生物限度檢驗(yàn)。

5 討論

《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)》(GB4789.1～GB4789.31—2010)只對食品的衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)提出一般性的方法，具有明顯的局限性。由于植物的生長環(huán)境的影響及生產(chǎn)工藝中大量使用防腐劑等因素使不同品種的樣品有可能存在抑菌性而影響試驗(yàn)結(jié)果，建議該標(biāo)準(zhǔn)增補(bǔ)方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)。

［1］國家藥典委員會.中國藥典 (二部)［S］.2010.

［2］衛(wèi)生部.GB/T4789.1～4789.31—2010.

［3］汪穗福，張新妹，蔡芷荷.微生物驗(yàn)證技術(shù)［M］.中國醫(yī)藥出版社.