熊 濤，馮 超，謝明勇

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

植物乳桿菌NCU116微膠囊制備工藝的優(yōu)化設(shè)計(jì)

熊 濤，馮 超，謝明勇

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

利用乳清蛋白中的β-乳球蛋白在低pH值及胃蛋白酶存在的情況下，依然能夠保持結(jié)構(gòu)完整的特性，本實(shí)驗(yàn)以脫脂乳作為壁材的成分之一，對(duì)植物乳桿菌NCU116微膠囊的制備工藝條件進(jìn)行研究。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化植物乳桿菌微膠囊制備條件。以經(jīng)過(guò)人工胃液處理后微膠囊中包埋的活菌數(shù)為響應(yīng)值，優(yōu)化后的最佳工藝條件為：海藻酸鈉質(zhì)量濃度2.68g/100mL，氯化鈣濃度0.20mol/L，脫脂乳質(zhì)量濃度4.17g/100mL。以該工藝條件制備的植物乳桿菌NCU116微膠囊粒徑為1.12mm，包封率在73.49%左右。經(jīng)過(guò)人工胃液處理3h后，微膠囊中的活菌數(shù)可達(dá)8.79×109CFU/g，與理論預(yù)測(cè)值(8.85×109CFU/g)較為接近。表明實(shí)驗(yàn)所制備的微膠囊具有較好的耐酸性。

植物乳桿菌NCU116；微膠囊；人工胃液；響應(yīng)面分析法

益生菌是與抗生素相對(duì)而言的概念，其定義為：通過(guò)改善腸內(nèi)菌群平衡，對(duì)宿主起到有益作用的活性微生物[1]。經(jīng)常服用益生菌，可預(yù)防和治療腹瀉，治療輕度潰瘍性結(jié)腸炎[2]。益生菌可以發(fā)酵乳糖生成更利于人體消化吸收的乳酸[3-4]；水解人體消化不完全的蛋白質(zhì)；增加可溶性鈣、磷及某些B族維生素的含量[5-6]。益生菌及其代謝產(chǎn)物能促進(jìn)人體消化酶的分泌和腸道的蠕動(dòng)，進(jìn)一步促進(jìn)食物的消化吸收。研究證實(shí)，乳酸菌是一類(lèi)對(duì)人體極為有利的益生菌[7-9]。隨著人們對(duì)乳酸菌研究的深入，其特有的功能使得微生態(tài)制品和乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品的應(yīng)用和發(fā)展受到食品行業(yè)的廣泛關(guān)注。近年來(lái)，益生菌獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)與保健作用逐漸得到認(rèn)可[10]。但是，目前絕大多數(shù)微生態(tài)活菌制劑存在著亟待解決的問(wèn)題就是：由于益生菌的耐受性較差，活菌制劑進(jìn)入消化道后多難以經(jīng)受低pH值的胃酸、膽汁酸、消化酶等的作用，使之難以有足夠的活菌數(shù)量到達(dá)腸道定殖并發(fā)揮作用，限制了益生菌生理作用的發(fā)揮。而采用微膠囊技術(shù)包埋益生菌，能增強(qiáng)菌體對(duì)外界環(huán)境的抵抗力，在腸道適當(dāng)條件的作用下益生菌又可以釋放出來(lái)，顯著提高了菌體在到達(dá)腸道后的存活率[11]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)人工模擬胃腸道環(huán)境，對(duì)微膠囊制備過(guò)程中的海藻酸鈉質(zhì)量濃度、脫脂乳質(zhì)量濃度和氯化鈣濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化以確定微膠囊制備的最佳工藝條件，以制備獲得具有較好耐酸性的微膠囊。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

植物乳桿菌NCU116由南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏，MRS培養(yǎng)基[12-13]。

胃蛋白酶(酶活力1:10000) 美國(guó)Sigma公司；海藻酸鈉、氯化鈣、脫脂乳、檸檬酸鈉。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50SⅡ/75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；Airtech生物安全柜 蘇凈集團(tuán)安泰公司；DNP-9272型生化培養(yǎng)箱、DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PB203-N型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；XSZ-4G型顯微鏡 重慶光電儀器有限公司；ZHWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；PHS-25型數(shù)顯pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 人工胃液[14]

取質(zhì)量濃度為0.1kg/L的鹽酸16.4mL，加蒸餾水稀釋?zhuān){(diào)節(jié)pH值至1.5。然后加入1g/100mL胃蛋白酶(100mL人工胃液中加入1g胃蛋白酶)計(jì)算，充分溶解后，用孔徑0.20μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，即得人工胃液。

1.4 方法

1.4.1 植物乳桿菌活菌計(jì)數(shù)

采用平板菌落計(jì)數(shù)法[15]。

1.4.2 菌種活化

將保存于4℃的植物乳桿菌菌種接入MRS液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)，進(jìn)行活化處理。

1.4.3 植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

在MRS液體培養(yǎng)基中接入活化后的植物乳桿菌，37℃厭氧培養(yǎng)，每隔3h取樣用0.85%生理鹽水10倍稀釋后測(cè)定活菌數(shù)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，考察植物乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性。

1.4.4 微膠囊的制備

將培養(yǎng)所得的處于穩(wěn)定期前期的植物乳桿菌經(jīng)離心分離后，棄上清，將收集到的菌體制成菌懸液，加入脫脂乳作為壁材成分之一，靜置一段時(shí)間，加入到冷卻好的滅菌的海藻酸鈉溶液中混合，攪拌均勻后，用玻璃注射器將混合液逐滴滴入冷卻好的滅菌的一定濃度的氯化鈣溶液中，固化一定時(shí)間，形成微膠囊，過(guò)濾取得樣品，用清水漂去氯化鈣殘液，再用滅菌0.85%生理鹽水洗滌微膠囊表面菌體，即得植物乳桿菌微膠囊。

1.4.5 微膠囊中菌體的釋放

將制得的微膠囊溶于檸檬酸鈉解囊液中，37℃條件下振蕩使其完全崩解，以供計(jì)數(shù)。

1.4.6 微膠囊顆粒粒徑的測(cè)定

隨機(jī)取制得的微膠囊顆粒若干，分別用游標(biāo)卡尺測(cè)量其粒徑，取其平均值。

1.4.7 微膠囊包封率測(cè)定[16]

微膠囊溶液的活菌數(shù)：取微膠囊溶液，在4500r/min條件下離心10min，取出后去上清液，加入檸檬酸鈉解囊液，37℃條件下振蕩使其完全崩解，測(cè)活菌數(shù)。未包埋的活菌數(shù)：取微膠囊溶液，用濾網(wǎng)過(guò)濾，并用生理鹽水沖洗，收集濾液，測(cè)活菌數(shù)(CFU/g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌NCU116生長(zhǎng)曲線(xiàn)

圖1 植物乳桿菌NCU116生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.1 Growth curve of Lactobacillus plantarum NCU116

由圖1可知，在0～6h，菌體處于延滯期，菌體數(shù)增長(zhǎng)緩慢；6～12h，菌體進(jìn)入旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體數(shù)呈現(xiàn)幾何型增長(zhǎng)；12～21h，菌體進(jìn)入穩(wěn)定期；21h以后，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，選定培養(yǎng)時(shí)間為18h的發(fā)酵液進(jìn)行離心操作。

2.2 不同固化時(shí)間對(duì)微膠囊中植物乳桿菌活菌數(shù)的影響

制備微膠囊時(shí)，需要用氯化鈣溶液進(jìn)行固化，其時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)微膠囊中包埋的活菌數(shù)會(huì)產(chǎn)生一定的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同固化時(shí)間對(duì)微膠囊植物乳桿菌活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of hardening time of capsule in calcium chloride onviability of encapsulated L. plantarum NCU116

由圖2可知，固化30min后，經(jīng)胃液處理后微膠囊中包埋的活菌數(shù)明顯高于只固化10min的情況。這是因?yàn)槲⒛z囊壁的厚度在固化的前15min快速增長(zhǎng)，之后，凝膠厚度緩慢增長(zhǎng)，最終達(dá)到最大值并穩(wěn)定[17]。隨著固化時(shí)間再延長(zhǎng)，由于微膠囊壁厚已達(dá)到最大值，因此也不會(huì)提高其對(duì)胃液的耐受性。在后續(xù)的試驗(yàn)中，選擇固化時(shí)間定為30～60min。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 海藻酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)微膠囊植物乳桿菌活菌數(shù)的影響

在脫脂乳質(zhì)量濃度為4g/100mL，氯化鈣濃度為0.2mol/L，海藻酸鈉質(zhì)量濃度為1、1.5、2、2.5、3g/100mL的條件下制備微膠囊。取微膠囊0.1g置于盛有50mL，pH1.5的人工胃液三角瓶中，于搖床中以37℃、180r/min處理，分別于0h和3h時(shí)取樣測(cè)定其活菌數(shù)，確定最佳的海藻酸鈉質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 海藻酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)微膠囊植物乳桿菌活菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of sodium alginate concentration on viability of encapsulated L. plantarum NCU116

由圖3可知，海藻酸鈉質(zhì)量濃度為1g/100mL時(shí)形成的微膠囊經(jīng)胃液處理后的活菌數(shù)最低，這是因?yàn)楹Ｔ逅徕c質(zhì)量濃度影響微膠囊機(jī)械強(qiáng)度，海藻酸鈉質(zhì)量濃度為1g/100mL條件下形成的微膠囊機(jī)械強(qiáng)度較低，囊壁較薄，對(duì)胃液的耐受性較弱。在其他條件不變的情況下，隨著海藻酸鈉質(zhì)量濃度提高，微膠囊機(jī)械強(qiáng)度逐漸增大，且包埋的活菌數(shù)逐漸增多。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量濃度為2.5g/100mL時(shí)，微膠囊中包埋的活菌數(shù)最多。但當(dāng)質(zhì)量濃度提高到3g/100mL時(shí)，活菌數(shù)略有下降。可能是由于海藻酸鈉質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，體系黏度也隨之增大，不利于菌體分散到其中，使包埋效果降低。

2.3.2 氯化鈣濃度對(duì)微膠囊植物乳桿菌活菌數(shù)的影響

在海藻酸鈉質(zhì)量濃度為2.5g/100mL，脫脂乳質(zhì)量濃度為4g/100mL，氯化鈣濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的條件下制備微膠囊。取微膠囊0.1g置于盛有50mL、pH1.5的人工胃液三角瓶中，于搖床中以37℃、180r/min處理，分別于0、3h時(shí)取樣測(cè)定其活菌數(shù)，確定最佳的氯化鈣濃度，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 氯化鈣濃度對(duì)微膠囊植物乳桿菌活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of calcium chloride concentration on viability of encapsulated L. plantarum NCU116

由圖4可知，隨著氯化鈣濃度的增加，經(jīng)胃液處理后微膠囊中包埋的活菌數(shù)也逐漸提高。原因是隨著氯化鈣溶液濃度的上升，溶液中可與海藻酸鈉結(jié)合的Ca2+含量增加，故而形成了更致密的凝膠結(jié)構(gòu)。氯化鈣濃度為0.2mol/L時(shí)，微膠囊中包埋的活菌數(shù)最多，繼續(xù)提高氯化鈣的濃度，活菌數(shù)基本保持不變，這是因?yàn)槲⒛z囊形成之后，所有Ca2+的結(jié)合位點(diǎn)已被占據(jù)，沒(méi)有多余的空間提供給Ca2+[18]，此時(shí)，隨著氯化鈣濃度的繼續(xù)提高，微膠囊性能也不會(huì)發(fā)生變化，所以對(duì)胃液的耐受性保持不變。

2.3.3 脫脂乳質(zhì)量濃度對(duì)微膠囊植物乳桿菌活菌數(shù)的影響

在海藻酸鈉質(zhì)量濃度為2.5g/100mL，氯化鈣濃度為0.2mol/L，脫脂乳質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4、5g/100mL的條件下制備微膠囊。取微膠囊0.1g置于盛有50mL、pH1.5的人工胃液三角瓶中，于搖床中以37℃、180r/min處理，分別于0、3h時(shí)取樣測(cè)定其活菌數(shù)，確定最佳的脫脂乳質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 脫脂乳質(zhì)量濃度對(duì)微膠囊植物乳桿菌活菌數(shù)的影響Fig.5 Effect of skim milk concentration on viability of encapsulated L. plantarum NCU116

由圖5可知，當(dāng)不添加脫脂乳作為壁材成分時(shí)，經(jīng)胃液處理后微膠囊中包埋的活菌數(shù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于添加脫脂乳之后的結(jié)果。當(dāng)脫脂乳的質(zhì)量濃度小于4g/100mL時(shí)，隨著脫脂乳質(zhì)量濃度的增加，經(jīng)胃液處理后微膠囊中包埋的活菌數(shù)也隨之增加。這是因?yàn)楫?dāng)pH值為1.5，且有胃蛋白酶存在的情況下，構(gòu)成乳清蛋白主要成分的β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)保持完整[19]。因此將脫脂乳作為壁材成分之一可以提高微膠囊對(duì)胃液的耐受性。但當(dāng)脫脂乳的質(zhì)量濃度達(dá)到5g/100mL時(shí)，活菌數(shù)略有下降。其原因可能是脫脂乳和海藻酸鈉混合后使整個(gè)溶液的黏度增大，影響了微膠囊的包埋效果。

2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以海藻酸鈉質(zhì)量濃度、氯化鈣濃度，脫脂乳質(zhì)量濃度為主要影響因素，由Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，以經(jīng)過(guò)胃液處理后微膠囊中的活菌數(shù)為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法對(duì)考察因素進(jìn)行優(yōu)化，確定較優(yōu)的擠壓制備工藝條件。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值Table1 Box-Behnken design and results

表2 回歸方程方差分析Table2 Variance analysis of the established regression equation

經(jīng)表1數(shù)據(jù)回歸擬合后，得到以胃液處理后的活菌數(shù)為響應(yīng)值的回歸方程為：Y＝8.79＋0.31A＋0.005B＋0.12C-0.43A2-0.37B2-0.56C2-0.022AB＋0.08AC-0.038BC。

經(jīng)Design-Expert軟件處理，回歸方程方差分析結(jié)果如表2所示。海藻酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)活菌數(shù)的影響極顯著(P＜0.0001)，脫脂乳質(zhì)量濃度的影響顯著(P＜0.05)，但氯化鈣濃度的影響不顯著(P＞0.05)。整體模型極顯著(P＜0.0001)。模型的失擬項(xiàng)相對(duì)于絕對(duì)誤差是不顯著的，而不顯著的失擬項(xiàng)才可取。調(diào)整后的多元相關(guān)系數(shù)為R2Adj=0.9851，表明其應(yīng)變量與全體自變量之間的多元回歸關(guān)系顯著，說(shuō)明該回歸方程對(duì)試驗(yàn)擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小，因此可以用該回歸方程對(duì)活菌數(shù)的變化進(jìn)行預(yù)測(cè)，并最終達(dá)到優(yōu)化植物乳桿菌NCU116微膠囊制備工藝的目的。

圖6 氯化鈣濃度和海藻酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)活菌數(shù)的影響Fig.6 Response surface plot showing the interaction effect of calcium chloride and sodium alginate concentrations on viability of encapsulated L. plantarum NCU116

圖7 脫脂乳質(zhì)量濃度和海藻酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)活菌數(shù)的影響Fig.7 Response surface plot showing the interaction effect of skim milk and sodium alginate concentrations on viability of encapsulated L. plantarum NCU116

圖8 脫脂乳質(zhì)量濃度和氯化鈣濃度對(duì)活菌數(shù)的影響Fig.8 Response surface plot showing the interaction effect of skim milk and calcium chloride concentrations on viability of encapsulated L. plantarum NCU116

從圖6～8上可形象地看出各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。圖6顯示，當(dāng)氯化鈣濃度一定時(shí)，活菌數(shù)隨著海藻酸鈉質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，并在海藻酸鈉質(zhì)量濃度為2.70g/100mL，氯化鈣濃度在0.20mol/L時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到峰值；圖7顯示，固定海藻酸鈉質(zhì)量濃度，隨著脫脂乳質(zhì)量濃度的增加，活菌數(shù)呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，并在海藻酸鈉質(zhì)量濃度為2.70g/100mL，脫脂乳質(zhì)量濃度為4.00g/100mL時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到峰值；圖8顯示，當(dāng)脫脂乳質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨著氯化鈣濃度的增加，活菌數(shù)呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，并在氯化鈣濃度為0.23mol/L，脫脂乳質(zhì)量濃度為4.20g/100mL時(shí)達(dá)到峰值。

2.4.2 微膠囊制備工藝條件的確定

通過(guò)回歸模型預(yù)測(cè)的植物乳桿菌NCU116微膠囊制備的最佳工藝條件為：海藻酸鈉質(zhì)量濃度2.68g/100mL，氯化鈣濃度0.20mol/L，脫脂乳質(zhì)量濃度4.17g/100mL，在此條件下，經(jīng)過(guò)胃液處理后，微膠囊中的活菌數(shù)理論上可達(dá)8.85×109CFU/g。

2.4.3 模型的驗(yàn)證

按照經(jīng)優(yōu)化后的工藝條件制備微膠囊，以進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。共進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均值為8.7 9× 109CFU/g，與模型預(yù)測(cè)值較為接近，說(shuō)明模型能較好地反映微膠囊制備過(guò)程中的3個(gè)因素對(duì)于包埋活菌數(shù)的影響，從而證明通過(guò)該試驗(yàn)優(yōu)化后得到的微膠囊制備工藝條件是真實(shí)可靠的。

3 結(jié) 論

以海藻酸鈉和脫脂乳作為壁材，采用擠壓法制備植物乳桿菌NCU116微膠囊，通過(guò)對(duì)微膠囊制備條件的優(yōu)化，確定制備的最佳工藝條件為：海藻酸鈉質(zhì)量濃度2.68g/100mL，氯化鈣濃度0.20mol/L，脫脂乳質(zhì)量濃度4.17g/100mL。在此工藝條件下，可制得粒徑為1.12mm的植物乳桿菌NCU116微膠囊，包封率在73.49%左右。經(jīng)過(guò)人工胃液處理3h后，微膠囊中的活菌數(shù)可達(dá)8.79× 109CFU/g。表明實(shí)驗(yàn)所制備的微膠囊具有較好的耐酸性。微膠囊化處理可以有效地保護(hù)植物乳桿菌NCU116順利地通過(guò)胃部環(huán)境，避免胃液的殺傷。

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Optimization of Microencapsulation Process for Lactobacillus plantarum NCU116

XIONG Tao，F(xiàn)ENG Chao，XIE Ming-yong
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Beta-lactoglobulin, the main whey protein in bovine milk, has been shown to remain intact in the presence of pepsin and low pH. Skim milk was used as a coating material to improve microencapsulation of Lactobacillus plantarum NCU116 in calcium alginate beads. On the basis of single-factor experiments, the optimization of microencapsulation conditions was carried out using response surface analysis to maximize viable cell count in microcapsules after treatment with artificial gastric fluid. The results showed that the optimal encapsulation conditions were sodium alginate 2.68 g/100 mL, calcium chloride 0.20 mol/L, and skim milk 4.17 g/100 mL. Under these conditions, the particle size of microcapsules, encapsulation rate and viable cell count in microcapsules after treatment with artificial gastric fluid for 3 h were 1.12 mm, 73.49% and 8.79 × 109CFU/g (close to the theoretical value, 8.85 × 109CFU/g), respectively. Thus the microencapsulation conditions presented in this study could effectively protect Lactobacillus plantarum from adverse gastric conditions.

Lactobacillus plantarum NCU116；microencapsulation；simulated gastric fluid；response surface analysis

TS201.3

A

1002-6630(2012)01-0152-05

2011-02-24

食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目(SKLF-MB-201003)；教育部留學(xué)回國(guó)人員創(chuàng)業(yè)基金項(xiàng)目(贛教財(cái)字[2009]135號(hào))

熊濤(1970—)，男，教授，博士研究生，研究方向?yàn)橐嫔按笞诠吒咧祷?。E-mail：xiongtao0907@163.com