金紹娣

（鹽城紡織職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程系，江蘇 鹽城 224005）

降血糖藥物二甲雙胍、殺菌劑雙胍氯己啶、雙胍辛醋酸鹽以及衍生物在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域顯示較高的抗菌和殺菌的生物活性[1~2]，通過雙胍基的活性基團(tuán)與生物體中的某些特定基團(tuán)或元素作用，使生物體正常的物質(zhì)和能量代謝發(fā)生改變。近年來雙胍的合成方法[3~5]不斷出現(xiàn)，而胺類與雙氰胺加成反應(yīng)制備芳基類雙胍是一 種較為簡單的好方法，原料易得，操作簡單，對試劑和儀器要求較低。本文以氨基苯甲酸為起始原料，合成了3種不同取代位置的雙胍基苯甲酸鹽酸鹽，并探討了其對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌的抑菌能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑和儀器

鄰、間、對雙胍基苯甲酸鹽酸鹽（自制）。

菌種：大腸桿菌 E.coli（ATCC 25922），金黃色葡萄球菌S.aureus（ATCC 6538）由鹽城工學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鄰、間、對雙胍基苯甲酸鹽酸鹽的制備

參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行制備。

1.3.2 最低抑菌濃度（MIC）測試

用接種環(huán)輕輕劃取一環(huán)菌種菌落至50mL營養(yǎng)肉湯(蛋白胨0.5g，氯化鈉0.25g，牛肉膏0.15g，去離子水50mL，pH6.8±0.1）中，于37℃全溫?fù)u瓶柜上120r·min-1培養(yǎng)至OD600值為0.5，以備抗菌測試。分別配制o、m、p-CPBGH水溶液，121℃高溫滅菌20min后，用2倍稀釋法溶于高溫滅菌后的營養(yǎng)肉湯中，分別配制最終濃度為256μg·mL-1、128μg·mL-1、64μg·mL-1、32μg·mL-1、16μg·mL-1、8μg·mL-1、4μg·mL-1、2μg·mL-1、1μg·mL-1、0μg·mL-1的溶液置于 10 支無菌試管中，取0.1mL OD600值為0.5的菌懸液于10mL上述各個濃度樣品中，震蕩均勻后置37℃全溫?fù)u瓶柜中振蕩培養(yǎng)24h，根據(jù)比濁法原理，用分光光度計測定OD值得最低抑菌濃度（MIC）。每一個菌種每一質(zhì)量濃度的樣品溶液平行做2次，繪制鄰、間、對雙胍基苯甲酸鹽酸鹽對E.coli和S.aureus的生長抑制曲線。

2 結(jié)果與討論

菌體接種到新鮮空白的液體培養(yǎng)基中后，開始并不是立即就繁殖，即表現(xiàn)出培養(yǎng)基吸光度值的增加。該階段主要是調(diào)節(jié)菌體體內(nèi)代謝酶系，以適應(yīng)新的環(huán)境。培養(yǎng)基中加入抗菌劑后，抗菌劑就會干擾微生物的體內(nèi)代謝活動?？咕鷦舛鹊蜁r，增加微生物自我調(diào)節(jié)的時間，直到抗菌劑被菌體體內(nèi)酶系代謝，或微生物自身酶系發(fā)生改變，產(chǎn)生了一定抗藥性才會生長。抗菌劑濃度足夠高時，有可能會徹底破壞微生物的生命活動，對微生物起到殺滅作用。因此，從菌體生長曲線的變化可看出抗菌劑對微生物抑菌能力的強(qiáng)弱、大小。

圖1和圖2分別為o,m,p-CPBGH對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌生長抑制曲線。

圖1 o,m,p-CPBGH對大腸桿菌生長抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of o,m,p-CPBGH on growth curve of E. coli

圖2 o,m,p-CPBGH對金黃色葡萄球菌生長抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of o,m,p-CPBGH on growth curve of S.aureus

結(jié)合圖1 的o，m，p-CPBGH對大腸桿菌生長抑制曲線可以看出，添加o，m，p-CPBGH后的大腸桿菌在相同時間內(nèi)繁殖的代數(shù)有所減少，從而在一定程度上抑制了大腸桿菌的生長。大腸桿菌在o，m，p-CPBGH溶液中培養(yǎng)后開始繁殖，吸光度增大，14h后添加o-CPBGH后的大腸桿菌生長曲線表現(xiàn)出明顯的抑菌能力，吸光度較低且穩(wěn)定，這可能是由于o-CPBGH易于形成六元環(huán)的螯合物，螯合細(xì)菌蛋白酶中金屬離子，破壞了菌體的新陳代謝；而添加m，p-CPBGH的大腸桿菌與空白相比，也有較好的抑菌效果。

由圖2的金黃色葡萄球菌生長抑制曲線可以看出，o，m，p-CPBGH的存在抑制金黃色葡萄球菌的生長，且抑菌效果優(yōu)于空白溶液。金黃色葡萄球菌在o，m，p-CPBGH溶液中培養(yǎng)后開始繁殖，吸光度增大，很明顯添加o-CPBGH后的金黃色葡萄球菌生長曲線表現(xiàn)出明顯的抑菌能力，培養(yǎng)14h后吸光度處于較低的值且穩(wěn)定；而添加m，p-CPBGH后的金黃色葡萄球菌與空白相比，也都有較好的抑菌效果。

表1 o，m，p-CPBGH抗菌活性的比較Table1 The antibacterial activities of o，m，p-CPBG

由表1可以看出o-CPBGH對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為0.064mg·mL-1和0.032mg·mL-1，m-CPBGH對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為0.128mg·mL-1和0.064mg·mL-1，p-CPBGH對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為0.128 mg·mL-1和0.064 mg·mL-1。雙胍可以通過絮凝作用凝固菌體的蛋白質(zhì)、磷壁酸、脂多糖，破壞菌細(xì)胞膜的滲透屏障，導(dǎo)致細(xì)菌的完整性破壞，營養(yǎng)物質(zhì)流失，達(dá)到抗菌的效果；或吸附帶有負(fù)電荷的細(xì)菌，干擾細(xì)胞壁的合成，使細(xì)胞壁溶解而死亡。鄰位雙胍的抑菌能力是間位和對位的2倍，鄰位雙胍基苯甲酸鹽酸鹽可能更易于形成六元環(huán)的螯合物，螯合細(xì)菌蛋白酶中金屬離子，影響細(xì)菌對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，導(dǎo)致菌體新陳代謝的紊亂，從而在殺菌和抑菌的能力方面要比間位和對位雙胍基苯甲酸鹽酸鹽所形成的相對不穩(wěn)定的七元環(huán)和八元環(huán)螯合物更強(qiáng)一些。

3 小結(jié)

抗菌實(shí)驗(yàn)表明，鄰、間、對雙胍基苯甲酸鹽酸鹽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均具有抑制作用，抗菌活性隨濃度的增加而增強(qiáng)，由于鄰位雙胍更易于形成六元環(huán)的螯合物，抑菌能力要強(qiáng)于間位和對位，擴(kuò)大了雙胍類藥物的抑菌范圍，具有作為一種新型抑菌劑的潛在應(yīng)用價值。

[1] 鄒曲輝，于世濤，劉福勝，等.雙胍辛醋酸鹽殺菌劑及其兩種中間體的合成與生物活性[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2003，15（6）：865-867.

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[6] 金紹娣，蔡照勝.鄰、間、對雙胍基苯甲酸鹽酸鹽的制備及其結(jié)構(gòu)表征[J].化工技術(shù)與開發(fā)，2011，39（8）：15-17.