馬 盼 明珍平 劉 镕 趙琴平 鐘沁萍 蔣明森 董惠芬

武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，武漢430071；＃通訊作者

目的：本課題組前期的研究結(jié)果顯示，在宿主因子作用下，日本血吸蟲(chóng)母胞蚴角化不良蛋白（DKC1）基因呈現(xiàn)差異表達(dá)。本研究克隆、表達(dá)DKC1基因，為后期研究日本血吸蟲(chóng)DKC1基因的功能奠定基礎(chǔ)。方法：通過(guò)搜尋DKC1基因的完整開(kāi)放閱讀框（ORF），設(shè)計(jì)并合成引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因片段，雙酶切，并將其與PET-28a（+）載體連接，轉(zhuǎn)化入DH5a大腸桿菌，經(jīng)PCR擴(kuò)增并測(cè)序鑒定后，抽提重組質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL21大腸桿菌中。PCR鑒定陽(yáng)性重組克隆后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE方法檢測(cè)表達(dá)結(jié)果，收集、純化重組蛋白。結(jié)果：通過(guò)設(shè)計(jì)上下游引物經(jīng)PCR法擴(kuò)增出約1 400bp的DNA片段；將DKC1與PET-28a（+）質(zhì)粒分別作BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，二者經(jīng)粘性末端連接并轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌，PCR篩選陽(yáng)性重組克隆測(cè)序表明，DKC1具有一個(gè)長(zhǎng)度為1 380bp的ORF，編碼460個(gè)氨基酸，理論分子量為51kDa，提取的重組質(zhì)粒PET-28a（+）-DKC1再轉(zhuǎn)化入BL21，以PCR鑒定獲得陽(yáng)性克隆后，IPTG誘導(dǎo)重組菌，產(chǎn)物行SDS-PAGE，成功獲得重組蛋白。結(jié)論：本研究成功克隆到DKC1基因，并成功構(gòu)建了重組載體，篩選到重組體，表達(dá)獲得重組蛋白，為鑒定其蛋白功能提供了條件。

＊國(guó)家自然科學(xué)基金（31000956）