董 毅，李月紅，張飛虎，夏瑞祥

生物治療是目前知道的唯一有望消滅腫瘤細(xì)胞的治療手段，生物治療將是腫瘤規(guī)范化治療方案中一個(gè)主要部分。腫瘤的有效治療，目前仍主要靠手術(shù)、放療和化療，它們的不徹底性和適應(yīng)證限制，以及對(duì)機(jī)體的過分傷害使其在臨床應(yīng)用上受到了一定的限制。針對(duì)那些不能手術(shù)、或手術(shù)后放化療不敏感的患者群及手術(shù)和放化療后應(yīng)需接續(xù)治療的患者，目前絕大部分醫(yī)療單位尚無行之有效的方法，所以實(shí)施腫瘤的生物治療方案已成為必然趨勢(shì)。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞( cytokine-induced killer cells，CIK)是生物治療中為數(shù)不多的同時(shí)具有廣譜“殺傷”、糾正免疫功能、增強(qiáng)患者對(duì)治療耐受性、實(shí)驗(yàn)技術(shù)成熟、臨床療效顯著、毒副作用小、患者易于接受的重要生物治療方法，亦是目前抗腫瘤最新、最好的免疫治療方法。CIK細(xì)胞免疫治療對(duì)多種腫瘤已顯示較好的臨床應(yīng)用前景，如白血病、淋巴瘤、肝癌、腎癌、肺癌、乳腺癌等［1-3］。但關(guān)于自體與異體CIK細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)的研究較少，本文通過比較自體與異體CIK細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)，以探討最有效的過繼免疫治療方法。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)材料 CD3McAb(美國(guó)Pharmacia公司)，rhIL-2，RPMI 1640，MTT(美國(guó)Sigma公司)，rhIL-1，rhIFN-γand rhTNF-α(美國(guó) Schering Plough公司)，抗 CD3-FITC、抗 CD4-FITC、抗CD8-FITC、抗CD56-FITC、熒光標(biāo)記的小鼠抗人HLADR-PE、CD1a-PE和CD14-PE(美國(guó)Gibco公司)。IL-12、IFN-γ、TNF-α試劑盒(深圳晶美生物制品公司)。流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)。白血病細(xì)胞株(K562細(xì)胞)、淋巴瘤細(xì)胞株(Raji細(xì)胞，上海生物制品研究所)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 CIK細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增 分別把自體與異體的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)人淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞，用PBS洗滌2次，懸浮于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，收集未貼壁細(xì)胞置于新的培養(yǎng)瓶中，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/m l，用于CIK細(xì)胞培養(yǎng)。當(dāng)日加入IFN-γ(1 000 U/ml)，24 h后加入CD3單抗(50μg/ml)、IL-2(300 U/ml)、IL-1α(100 U/ml)，以后每3天補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，并補(bǔ)加IL-2(300 U/ml)。

1.2.2 腫瘤細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 將Raji細(xì)胞及K562細(xì)胞加入含10%FBS的1640培養(yǎng)基懸浮，置于37℃，5%CO2，飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 殺傷活性測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞及K562細(xì)胞用0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)，作為靶細(xì)胞，異體CIK細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml作為效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例為5:1，10:1，20:1，40:1，自體CIK細(xì)胞作為陰性對(duì)照，置于96孔板，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。置于37℃，5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT20μl繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀在570nm處讀數(shù)，測(cè)定OD值，計(jì)算殺傷活性。殺傷活性(%)=［1-(實(shí)驗(yàn)孔OD值—效應(yīng)孔OD值)/靶細(xì)胞孔OD值］×100%。

1.2.4 細(xì)胞的免疫表型檢測(cè) 取培養(yǎng)7 d自體與異體的CIK細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫表型。

1.2.5 細(xì)胞因子分析 用ELISA雙抗體夾心法測(cè)定干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0軟件分析結(jié)果。結(jié)果用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自體與異體CIK細(xì)胞增殖能力分析 CIK培養(yǎng)第3～4天開始增殖，第7天數(shù)量明顯增多。來自異體的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)后CIK細(xì)胞增殖速率明顯提高。培養(yǎng)第15天，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，自體CIK細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增到原來的(48.52± 4.78)倍，而異體CIK細(xì)胞為(102.34±6.63)倍，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見圖1。

圖1 自體與異體CIK細(xì)胞增殖能力分析

2.2 自體與異體CIK細(xì)胞殺傷活性測(cè)定 用MTT比色法測(cè)定2組細(xì)胞對(duì)Raji腫瘤細(xì)胞，K562腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，結(jié)果表明，隨著效靶比的增加，各組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶殺傷活性也增加;同一效靶比下，各組效應(yīng)細(xì)胞殺傷活性不同，其中異體CIK對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性最強(qiáng)(P＜0.01)。見圖2與圖3。

圖2 自體與異體CIK細(xì)胞對(duì)Raji細(xì)胞殺傷能力分析

2.3 自體與異體CIK細(xì)胞免疫表型檢測(cè) CIK細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CD3+CD8+及CD3+CD56+細(xì)胞的比例逐漸增加，異體CIK細(xì)胞CD3+CD8+及CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞的比例明顯高于同條件下自體CIK細(xì)胞組(P＜0.05)。見表1。

圖3 自體及異體CIK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞殺傷能力分析

2.4 自體與異體CIK細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子分析 檢測(cè)培養(yǎng)7天的CIK細(xì)胞分泌的IFN-γ、IL-12、TNF-α的水平，異體CIK細(xì)胞組明顯高于自體CIK細(xì)胞組(P＜0.05)。見表2。

表1 自體及異體CIK細(xì)胞免疫表型(±s，%)

表1 自體及異體CIK細(xì)胞免疫表型(±s，%)

CD3+ CD3+/CD4+ CD3+/CD8+CD3+/CD56+自體CIK細(xì)胞62.34±11.78 25.15±5.82 36.56±7.11 26.91±6.類別36異體CIK細(xì)胞81.02±15.52 16.35±5.41 52.11±9.73 39.64±8.02 t值2.524 8.111 10.997 9.002 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表2 自體及異體CIK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(±s，ng/L)

表2 自體及異體CIK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(±s，ng/L)

類別 IFN-γ IL-12 TNF-α 315.12±69.61 15.56±4.71 108.35±24.56異體CIK細(xì)胞 491.27±88.43 28.16±6.91 158.11±39.34 t值自體CIK細(xì)胞＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 11.291 10.512 2.488 P值

3 討論

CIK細(xì)胞是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子(如抗CD3McAb、IL-2、IFN-γ、IL-1α等)共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞。由于該種細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故又被稱為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗癌癥和腫瘤活性和NK細(xì)胞的非主要組織相容性復(fù)合體限制性殺癌癥和腫瘤優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用CIK細(xì)胞被認(rèn)為是新一代抗癌癥和腫瘤過繼細(xì)胞免疫治療的首選方案。CIK細(xì)胞治療是近年來開展的一種全新的腫瘤免疫治療方法，對(duì)CIK細(xì)胞的體外培養(yǎng)特性及對(duì)實(shí)體瘤的治療效果已做了大量的臨床觀察和探索。CIK細(xì)胞由CD3、CD4、CD8、CD3+CD56+、CD3-CD56+等不同陽性標(biāo)記細(xì)胞組成，其發(fā)揮殺傷作用主要是CD8和CD3+CD56+細(xì)胞。流式細(xì)胞儀測(cè)定顯示，CIK細(xì)胞群中CD8、CD3+CD56+陽性細(xì)胞比例明顯升高，尤其是CD3+CD56+細(xì)胞更為突出，表明CIK有更強(qiáng)的殺滅腫瘤功能，更適合應(yīng)用于臨床。CIK細(xì)胞可用于下述腫瘤患者的輔助治療:(1)手術(shù)后患者，可防止腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā);(2)無法進(jìn)行手術(shù)、放療、化療的中晚期患者;(3)放療、化療失敗的患者;(4)放療或化療后患者的綜合治療;(5)骨髓移植后或化療緩解后的白血病患者;(6)癌性胸、腹腔積液患者。

CIK細(xì)胞的抗瘤效果主要與其殺傷活性及效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例有關(guān)，理論上，CIK細(xì)胞的殺傷活性越高，輸注的細(xì)胞數(shù)越多對(duì)腫瘤的治療效果越好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:培養(yǎng)12～15 d的CIK細(xì)胞群增殖倍數(shù)最高，因此培養(yǎng)2周的CIK細(xì)胞可用于臨床治療。關(guān)于治療中輸注細(xì)胞量的問題，每療程輸注的細(xì)胞數(shù)大于(3～5)×109時(shí)，出現(xiàn)明顯的治療效果。臨床觀察表明，CIK細(xì)胞治療腫瘤的總有效率為35.7%，不同腫瘤的療效并不相同。目前，CIK細(xì)胞主要用于自體骨髓移植物的凈化、微小殘留病灶的清除及晚期惡性腫瘤(包括急慢性血液系統(tǒng)惡性疾病和各種實(shí)體瘤)的免疫治療。CIK細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ和TNF–α有顯著的數(shù)額，但只產(chǎn)生微量的IL-2和IL-4和IL-5，在一個(gè)30:1的效應(yīng)靶細(xì)胞比例，CIK細(xì)胞摧毀人肝癌細(xì)胞，1×106個(gè)CIK細(xì)胞抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，這項(xiàng)研究表明，CIK細(xì)胞可作為過繼免疫治療用于原發(fā)性肝癌患者。BorleriG等［4］發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞聯(lián)合造血干細(xì)胞移植，顯示較好的抗白血病活性且不增加移植物抗宿主反應(yīng)，這些自體細(xì)胞的安全性被證明。急性白血病患者化療加CIK細(xì)胞與單純化療相比較完全緩解率明顯增高［5］。對(duì)淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、肺癌等腫瘤的治療達(dá)到同樣的效果［6］。

在這項(xiàng)研究中，我們比較了自體與異體CIK細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:異體CIK有更強(qiáng)的增殖能力，培養(yǎng)第15天，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，自體CIK細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增到原來的(48.52±4.78)倍，異體CIK細(xì)胞為(102.34±6.63)倍，用MTT比色法測(cè)定自體與異體 CIK細(xì)胞對(duì)Raji腫瘤細(xì)胞和K562腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，結(jié)果表明，隨著效靶比的增加(5: 1，10:1，20:1，40:1)，各組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶殺傷活性也增加;同一效靶比下，各組效應(yīng)細(xì)胞殺傷活性不同，異體CIK對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性最強(qiáng)，顯著提高了抗腫瘤活性［7-8］。異體CIK細(xì)胞CD3+CD8+及CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞的比例明顯高于同條件下自體CIK細(xì)胞組。異體CIK細(xì)胞促進(jìn)了IFN-γ、IL-12、TNF-α的分泌，保持了CIK細(xì)胞活性，與報(bào)道一致［9-10］。

經(jīng)過化療和放射治療，癌癥患者往往會(huì)出現(xiàn)白細(xì)胞減少，貧血及其他嚴(yán)重副作用，免疫功能遭到嚴(yán)重破壞，外周血中單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)少于健康人，此外，由單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞數(shù)量及生物活性明顯降低，異體CIK細(xì)胞有IFN-γ、IL-12、TNF-α的高分泌，提高了CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和增值率，臨床研究和體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已經(jīng)表明，異體細(xì)胞免疫治療不僅大大提高了抗腫瘤效應(yīng)，且無自身免疫反應(yīng)及其他副作用，顯示較好的安全性，提供了一個(gè)過繼細(xì)胞免疫治療的新方法。異體CIK細(xì)胞將具有廣泛的臨床應(yīng)用前景，在抗腫瘤免疫治療中將發(fā)揮重要作用［11-12］。

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