劉仁輝

手足口病(Hand footmouth disease，HFMD)是由多種腸道病毒引起的急性傳染病，引起HFMD的腸道病毒有20多種，主要是小RNA病毒科腸道病毒屬的一組腸道病毒，其中腸道病毒71型(EV71)及柯薩奇病毒16型(CoxA16)最常見，其中EV71型感染常導(dǎo)致重癥HFMD。EV71手足口病流行以來，多數(shù)患兒預(yù)后良好，但少數(shù)患兒可出現(xiàn)重癥病例，易并發(fā)無菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫和呼吸循環(huán)衰竭導(dǎo)致患兒死亡以及出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)損害導(dǎo)致身體殘疾等.由于此病對嬰幼兒和兒童的危害主要表現(xiàn)為重型有較高的病死率和殘死率，嚴重危害兒童身體健康和生命安全，因此被喻為二十一世紀的“脊髓灰質(zhì)炎”。

我國衛(wèi)生部于2008年5月2日起，將其列為丙類傳染病。資料表明EV71手足口病發(fā)病率在我國正逐年大幅度成倍數(shù)上升，重型手足口病和死亡人數(shù)也明顯增多。EV71變異快，存在10多個亞型，各亞型和其它腸道病毒缺少交叉免疫保護作用，因此人群普遍易感［1-4］。該病傳播途徑復(fù)雜，隱性感染者比例大，在嬰幼兒之間傳染性強，加之目前缺少有效的疫苗，預(yù)防措施主要是通過切斷傳播途徑如加強通風、改善個人衛(wèi)生和早期的報告、隔離、診治和管理制度等，目前該病的發(fā)病機制尚未完全清楚。EV71感染引起的手足口病在臨床表現(xiàn)上與柯薩奇病毒、埃可病毒等20多種病毒感染所引起的手足口病難以區(qū)別.因此早期明確診斷是何種病毒感染導(dǎo)致的手足口病，對預(yù)防和控制EV71傳播，早期積極治療對減少EV71感染引起的嚴重并發(fā)癥和減少死亡病例，具有十分重要的意義。本文就手足口病實驗室分型檢測技術(shù)研究進展方面內(nèi)容進行綜述。

1 手足口病的發(fā)現(xiàn)和命名

1957年新西蘭首次報道導(dǎo)兒童出現(xiàn)以手、足、口腔等部位的皮疹、潰瘍?yōu)樘卣鞯募膊×餍校?958年在患兒糞便中分離出柯薩奇病毒(CoxAsckievirus)A16型(Cox A16)，1959年命名為HFMD。人類腸病毒71型最早于1969年首次從加利福尼亞患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的手足口病嬰兒糞便標本中分離出來的［5］，這些病毒可被培養(yǎng)在恒河猴腎臟細胞(rhesus monkey kidney cell;RhMK)及人類胎兒雙套細胞中。經(jīng)由這些細胞培養(yǎng)后純株化病毒分析，發(fā)現(xiàn)會出現(xiàn)典型由腸病毒所致的細胞病變(cytopathetic effect;CPE)現(xiàn)象，由電子顯微鏡下觀察其形態(tài)及物理化學(xué)特性都與當時已知的其他腸病毒類似.但進行中和抗體試驗或免疫擴散試驗后，卻發(fā)現(xiàn)其彼此間并不會有交互作用的現(xiàn)象。因此推測當時所發(fā)現(xiàn)的病毒為一種新型的腸病毒。鑒于這種情況，1970年研究者將該病毒視為一種新型腸病毒，命名為腸病毒71型(Human enterovirus 71，EV71)。

2 EV71病原學(xué)

2.1 EV71形態(tài)結(jié)構(gòu)及基因結(jié)構(gòu) EV71是小RNA病毒科腸道病毒屬成員。由一個非包膜病毒衣殼環(huán)繞一個核心組成，EV71的病毒顆粒為二十面體立體對稱的球形結(jié)構(gòu)，無包膜和突起，直徑大約在24～30 nm。EV71病毒核心為7408個核苷酸的單股正鏈RNA病毒基因組，基因組中僅有一個開放閱讀框，編碼含2194個氨基酸的多聚蛋白在其兩側(cè)為5’和3’一非編碼區(qū)(UTRs)，在3’非編碼區(qū)的末端含有一個長度可變的多聚腺苷酸尾巴(poly-A)。病毒的單鏈RNA具有感染性，如果去除3’末端的多聚腺苷酸尾或基因組出現(xiàn)斷裂，感染性就會消失.該多聚蛋白可進一步被水解成P1、P2、P33個前體蛋白，P1前體蛋白編碼VP1、VP2、VP3、VP4 4個病毒外殼蛋白;P2和P3前體蛋白編碼7個非結(jié)構(gòu)蛋白(2A～2C和3A～3D).病毒粒子的衣殼由6個亞單位構(gòu)成，后者又是由4種衣殼蛋白(VP1～VP4)拼裝成的五聚體樣結(jié)構(gòu)。4種結(jié)構(gòu)蛋白中，除VP4包埋在病毒粒子外殼的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接以外，其它3種結(jié)構(gòu)蛋白均暴露在病毒顆粒的表面，因而抗原決定簇基本上位于VP1～VP3上，病毒衣殼與病毒毒力有關(guān)，VP1作為EV71相對保守的衣殼結(jié)構(gòu)，可調(diào)節(jié)病毒吸附和脫殼，可能成為抗腸道病毒的1種蛋白［6］，VP1蛋白也是主要的病毒中和決定因子，它直接決定病毒的抗原性.VP1基因具有與病毒血清型完全對應(yīng)的遺傳多樣性［7］，由891個核苷酸組成的VP1是EV71疫苗發(fā)展的主要靶蛋白［8］。

2.2 EV71病毒的感染與復(fù)制 EV71病毒的復(fù)制發(fā)生在宿主細胞漿內(nèi)［9］，首先病毒與細胞膜表面受體相結(jié)合，然后借助細胞的內(nèi)吞作用進入細胞，或通過與細胞膜進行融合進行脫衣殼而將病毒RNA釋放進細胞。由于宿主細胞內(nèi)缺乏EV71基因組RNA進行復(fù)制的RNA聚合酶，所以病毒進入細胞漿后必須首先進行基因組的轉(zhuǎn)錄和翻譯。EV71病毒的復(fù)制與其它正鏈RNA病毒相似，首先病毒RNA作為mRNA翻譯成病毒蛋白，包括RNA復(fù)制酶，然后形成RNA的復(fù)制中間型(replicative intermediate，RI)，從而合成互補負鏈，而負鏈又在復(fù)制酶的催化下在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進一步大量合成正鏈RNA。隨著大量病毒正鏈RNA在細胞漿內(nèi)的堆積，病毒逐漸進入子代病毒的包裝過程。該過程比較復(fù)雜，一般首先由5個未切割的P1蛋白相互凝集，P1前體蛋白切割后形成5個形狀相同的凝集體，即五聚體(pentamer);然后12個五聚體沿著一個二十面體的12個頂點形成前衣殼，這也即是具有接受RNA分子能力的前毒粒，所以EV71是由60個相同的亞單位組成;最后1AB經(jīng)宿主酶切割成VP4、VP2，以進一步穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生完全成熟的子代病毒粒子。

3 實驗室診斷

3.1 病毒分離 EV71感染診斷的“金標準”是細胞培養(yǎng)分離病毒［10］常用的分離方法有細胞接種和乳鼠接種?；颊呒S便標本是最常采集的標本，其它如咽拭子或咽喉洗液、腦脊液、皰疹液或血清以及腦、肺、脾、淋巴結(jié)等組織標本［11］。70年代中期應(yīng)用綠猴腎細胞(Vero)培養(yǎng)和新生白鼠接種成功分離病毒，近年來應(yīng)用人源細胞如W1-38、橫紋肌瘤細胞(RD)進行病毒分離。對于所有懷疑含EV71、CA16的標本均需接種到RD和HEp-2(來源于人喉癌上皮細胞)2種細胞系，聯(lián)合使用上述2種或更多細胞(如Vero細胞)有助于分離到更多的腸道病毒。病毒分離培養(yǎng)對流行病學(xué)分析具有重要意義，由于病毒培養(yǎng)耗時，一般需要4～15 d或更長的時間，往往貽誤特異性治療，同時對診斷某些EV血清型的敏感性也欠佳，使得其對臨床診斷有一定的限制性，該方法病毒分離的敏感度也依賴于標本的采集、類型、質(zhì)量以及所用細胞的類型，病毒分離培養(yǎng)對技術(shù)要求較高，費用較貴，耗時需要，且各實驗室分離陽性率各不相同，屬于勞動力復(fù)合密集型，無法滿足病毒流行期間同時處理大量樣本的實際需要.盡管其檢測靈敏度比PCR法要低且耗時較長，但對于一些含有PCR抑制因素的樣品來說，病毒分離方法也許是唯一的PCR法不能取代的檢測方法。

3.2 血清學(xué)檢測 血清學(xué)方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA)、中和抗體檢測、補體結(jié)合試驗(complement fixationtest，CF)等，通過對單份血或急性期和恢復(fù)期雙份血進行抗體測定作出診斷.但EV血清型繁多，臨床使用價值有限，流行病學(xué)調(diào)查采用比較多。目前國內(nèi)有間接ELISA檢測試劑盒提供，可進行臨床患者某些型別腸道病毒的IgM血清學(xué)檢測而進行診斷，該方法只用急性期單份血清，對臨床早期診斷有重要價值。ELISA法快速、經(jīng)濟，應(yīng)用較為廣泛，檢測人雙份血清標本的中和抗體滴度時通常需用急性期血清與恢復(fù)期血清滴度進行比較，抗體滴度≥4倍增高證明病毒感染.由于從病毒感染到抗體出現(xiàn)需要一定時間，因此ELISA法用于疾病的早期診斷靈敏度不高.利用ELISA捕捉法或間接法檢測早期患者血清中的IgM和IgG抗體，是較常用的檢測指標，ELISA法相對而言簡便、快速、不需要非常專業(yè)的技術(shù)人員，且對實驗室的要求也不高，適合用于普通實驗室.但是有研究結(jié)果顯示，ELISA法的敏感性低于PCR法［12］。

手足口病抗體檢測的最常用方法目前仍是中和實驗，該方法精確且具有型特異性。如做抗體測定，必須采集2份血清標本。第1份(急性期)在發(fā)病時盡早采集，第2份在發(fā)病后1個月左右采集。臨床分析結(jié)果時注意:(1)如果檢測患者血清中特異性IgM抗體陽性，或急性期與恢復(fù)期血清IgG抗體有4倍以上的升高，可為實驗室診斷病例。(2)當無法進行病毒分離或得不到適用于病毒分離用的標本時，血清學(xué)檢測可以為腸道病毒的感染提供一個間接的證據(jù)。但是，無癥狀的腸道病毒感染也是常見的，所以對檢測結(jié)果的解釋要慎重一些。(3)由于IgG抗體產(chǎn)生需要一定時間，而且在感染早期，抗體的濃度亦較低.血清學(xué)抗體檢測可能滯后于其他檢測判斷。

3.3 分子生物學(xué)檢測

3.3.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCR PCR技術(shù)是一種敏感特異的腸道病毒快速檢測分型方法對于疾病的早期診斷及防控具有重大意義。PCR技術(shù)自問世后即被用于檢測EV幾乎可檢出所有的血清型，與傳統(tǒng)方法相比具有較好的敏感性、特異性和較高的檢出率，由于檢測材料用量少、快速、靈敏度高且具有很高的特異性，在病毒感染的實驗室診斷中起著越來越重要的作用。

近年來，PCR技術(shù)已成為診斷腸道病毒感染最常用的一種方法，PCR測序技術(shù)則可用于EV71病毒基因分型，可進行大規(guī)模的分子流行病學(xué)調(diào)查。引起手足口病的病毒主要為小RNA病毒科腸道病毒屬成員，病毒核酸為RNA，在進行病毒核酸檢測時，需首先進行逆轉(zhuǎn)錄，將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再進行特異DNA序列的擴增和檢測，即RT-PCR方法。應(yīng)用RT-PCR檢測EV71的優(yōu)點是快速、方便及敏感性高。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)克服了病毒分離培養(yǎng)和血清學(xué)方法相對繁雜費時，且在病毒流行期間無法滿足同時處理大量樣本的缺點，已成為腸道病毒感染快速診斷的重要手段。

3.3.2 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR是在傳統(tǒng)RT-PCR的方法上進行改良的方法采用特異性標記的熒光探針，利用熒光信號積累實時測整個PCR進程，使每一個循環(huán)變得“可見“最后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA起始濃度進行定量的方法，該檢測方法已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于各種病原的檢測［13］。該方法具有不易污染，特異性強，操作簡便等優(yōu)點，可用于手足口病暴發(fā)疫情和臨床病例的早期高通量快速診斷。經(jīng)研究表明［14］實時熒光定量PCR法與RT-PCR陽性和陰性符合率均為100%，表明實時熒光定量PCR法特異性與準確性與RT-PCR法相當。與RT-PCR相比，實時熒光定量PCR反應(yīng)和分析在完全閉管的條件下進行，能有效防止PCR產(chǎn)物的污染，提高檢測結(jié)果的可靠性;試劑在PCR檢測儀上進行擴增和分析，無需電泳和紫外燈觀測等步驟，從標本處理開始只需要3～4 h即可完成檢測，節(jié)省了檢測時間。

3.3.3 內(nèi)標多重熒光 RT-PCR采用TaqMan探針，建立含有監(jiān)控內(nèi)標(Internal Control，IC)同時檢測EV71和CA16的多重熒光RT-PCR檢測方法，內(nèi)標同步參與樣品核酸的提取，不僅能夠有效地監(jiān)控樣本中的抑制物，還能避免了操作誤差所造成的假陰性.該方法可靠性強，無假陰性結(jié)果，能同步檢測EV71和CA16。為了對當前暴發(fā)的手足口病進行快速準確的檢測.肖性龍等［15］研究建立了含內(nèi)標的同時檢測EV71和CA16的多重熒光RT-PCR方法，對該方法的特異性、靈敏度等進行評估，研究表明，該檢測方法特異性強，比傳統(tǒng)方法的陽性檢測率高。另外，實驗數(shù)據(jù)顯示，在糞便、直腸拭子、咽喉拭子樣本中，PCR抑制物存在的比例為1.8%～3.4%，表明內(nèi)標對監(jiān)控PCR抑制物的存在具有重要作用。本方法能同時對EV71和CA16進行快速檢測，并且靈敏度高，特異性好，由于加入了內(nèi)標，能有效地監(jiān)控假陰性的出現(xiàn)，適合于手足口病的臨床檢測.

3.3.4 異源雙鏈核酸泳動分析(heteroduplex mobility analysis，HMA) 以EV71的5＇-NTR為模板進行RT-PCR擴增，應(yīng)用HMA分析擴增產(chǎn)物.優(yōu)點是通過比較異源雙鏈核酸的泳動模式和核酸序列，準確分析感染病毒是否同一基因型，是否存在變異及變異的程度［16］。也可應(yīng)用HMA研究流行期間病毒準種及優(yōu)勢株(Major varants)的變化。

3.3.5 RT-PCR聯(lián)合芯片技術(shù) 芯片技術(shù)克服了血清學(xué)方法常常不能同時準確進行多個病毒分型的缺點，利用它的高通量特性，能同時檢測EV71和CA16并進行基因分型.首先需對不同腸道病毒亞型數(shù)據(jù)庫進行精確生物分析，然后設(shè)計多個血清型特異的寡核苷酸探針進行病毒檢測。Chen TC等［17］應(yīng)用RT-PCR聯(lián)合芯片技術(shù)檢測144例HFMD患者標本，同時所有標本再應(yīng)用real-time PCR分析，然后由中和實驗證實。發(fā)現(xiàn)RT-PCR聯(lián)合芯片技術(shù)對EV71和CA16的診斷準確率分別高達92.0%和95.8%。提示這個高度敏感的芯片基礎(chǔ)的檢測有望成為未來EV71和CA16感染的臨床診斷方法。

綜上所述，病毒分離鑒定方法繁雜費時，血清學(xué)檢測方法靈敏度不高，PCR法尤其是多重RT-PCR法靈敏度高，特異性好可靠性強，對于疾病的早期診斷及防控有重大意義，在疫情暴發(fā)時，為了提高檢測速度和準確性，目前多使用PCR方法。雖然PCR法優(yōu)點很多，仍無法取代傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法，而且PCR法需要昂貴的儀器設(shè)備，檢測試劑也比前2種檢測方法成本高，對于基層醫(yī)療機構(gòu)來說難以推廣使用，因此今后需要進一步完善手足口病原體檢測技術(shù)，特別是快速、準確、操作簡單、成本低廉的檢測技術(shù)。

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