王 麗

(1.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.寶雞市產品質量監(jiān)督檢驗所，陜西 寶雞 721000)

0 引言

食品是人類生存的基礎，添加適量的防腐劑是防止食品腐敗變質最通用的方法；但過量或非法的添加在一定程度上危害人體健康，甚至威脅人類生命[1].因此，食品防腐劑的安全性及檢測方法已成為焦點,各個國家的研究者都在努力尋求有效便捷的食品防腐劑檢測方法[2-4].

苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸酯類是目前食品工業(yè)中應用廣泛的添加劑[5].GB/T5009.29-2003記載了果汁等苯甲酸、山梨酸的測定方法為氣相色譜法、薄層色譜法和高效液相色譜法，但檢測范圍有限[6]；GB/T5009.121-2003采用氣相色譜法檢測腐乳、醬菜等食品中脫氫乙酸含量，樣品前處理繁冗[7].并且國標只能針對某種食品中的一類防腐劑進行測定，而同時測定食品中5種防腐劑的方法也鮮見報道.

現(xiàn)今食品防腐劑的種類及適用范圍不斷增加，添加方法不斷變更，過于單一的檢驗方法已不能完全滿足當前檢驗工作的需要[8-10].本文采用高效液相色譜法對食品中苯甲酸等5種防腐劑同時進行測定，簡化樣品前處理程序，提高了檢測效率，獲得較好的檢測效果.

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

1.1.1 儀器

日本島津高效液相色譜儀(SHIMADZU CLASS-VP l0AT)，美國安捷倫色譜柱(TC-C18)，梅特勒一托利多電子天平(AL104)，江蘇昆山超聲波清洗器(KQ3200)，天津奧特賽恩斯手提式真空泵(SCIENCE AP-O1)，上海安亭臺式離心機(TDL-4)，大龍手動可調式移液槍等.

1.1.2 試劑

標準品：苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯(含量>99.0%，天津科密歐).

試劑：乙醇、乙腈(含量為99.9%，上海國藥集團)；乙酸銨、乙酸鋅、石油醚、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀等化學試劑(分析純，天津科密歐)；瓶裝純凈水(娃哈哈).

1.2 色譜條件

色譜柱為Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動相A相為100%乙腈，B相為0.02 mol/L乙酸銨水溶液，采用梯度洗脫程序，如表1所示；流速：1.000 mL/min；柱溫：35 ℃；波長：254 nm；進樣量：10μL.

表1 防腐劑的液相色譜的洗脫梯度

1.3 試劑配制

單一標準儲備液的配制：稱取苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸乙酯及對羥基苯甲酸甲酯標準品各0.050 0 g，用乙醇溶解并定容至50 mL，終濃度為1 mg/mL， 4 ℃保存.

混合標準溶液的配制：分別用移液槍吸取上述防腐劑單標儲備液1 mL于10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，即得防腐劑混合標準溶液，濃度為100 mg/L.用乙醇逐級稀釋至一系列濃度：10 mg/L，5 mg/L，1 mg/L，0.5 mg/L ，0.1 mg/L，0.05 mg/L，0.01 mg/L.

1.4 樣品前處理

液體樣品：取5 mL樣品于50 mL比色管中，調pH6-7后，加入30 mL蒸餾水稀釋，如樣品富含蛋白質，加入2.5 mL乙酸鋅和2.5 mL亞鐵氰化鉀沉淀蛋白，純水定容至刻度后再經0.22μm濾膜過濾，收集濾液備用；如樣品富含脂肪，則烘干后用氫氧化鈉溶液調至堿性，反復加入石油醚脫脂，棄去石油醚層，將剩余物轉入容量瓶中，靜置分層，取上清液過0.22μm濾膜過濾，收集濾液備用.

固體樣品：稱取樣品5 g粉碎，若樣品中蛋白含量低，用水直接溶解并定容，再經0.22μm濾膜過濾，合并濾液備用；若蛋白含量高，則需先加入2.5 mL乙酸鋅和2.5 mL亞鐵氰化鉀來沉淀蛋白，收集上清液再定容至所需刻度.

2 結果與討論

2.1 高效液相色譜檢測條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

min圖1 五種防腐劑的標準液色譜圖

因所測樣品可溶于水相中，結合實驗室的條件，選用Agilent TC-C18色譜柱進行分析.

2.1.2 檢測器波長的選擇

采用二極管陣列檢測器分別對上述5種防腐劑的單一標液進行掃描，測得苯甲酸的最大吸收峰在228 nm處；山梨酸的最大吸收峰在260 nm處；脫氫乙酸在234 nm處；對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸乙酯均在254 nm處；而5種防腐劑在254 nm波長處有共同較大吸收峰.故確定254 nm為程序的測定波長.

2.1.3 流動相的選擇

分別使用甲醇-水和乙腈-水作為流動相洗脫樣品，結果表明在乙腈-水的流動相體系中5種防腐劑可以取得較好的色譜分離效果.

實驗選擇乙腈-水作為流動相體系，對水相的pH值和緩沖液濃度進行考察，結果表明在水相中添加0.02 mol/L乙酸銨的緩沖鹽，可以有效控制流動相的pH波動，使所測5種防腐劑分開.由于苯甲酸與山梨酸的保留時間相近，而苯甲酸、山梨酸和對羥基苯甲酸甲酯之間的性質相差較大，為保持良好的分離度，實驗采用梯度洗脫，詳情如表1所示.

2.1.4 柱溫的選擇

實驗結果表明，液相色譜檢測器的溫度對防腐劑的測定結果影響作用較微.但為了使實驗結果更精密準確，本方法檢測時控制柱溫在35 ℃左右.

2.2 方法的評價

2.2.1 色譜分離效果

分別取苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯標液及以上5種防腐劑的混合標準液，按上述色譜條件進行測定，結果如圖1所示.結果顯示：采用高效液相色譜法，按上述色譜條件進行測定，方法專屬性較高，5種防腐劑都達到了較好的分離效果，且在9 min內得到了分離.

2.2.2 線性關系及檢出限

將苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸乙酯的標準液配制成0.01～40 mg/L的一系列梯度濃度，按上述優(yōu)化后的色譜條件分別測定，采集信號，并繪制出對應線性曲線，計算曲線的相關系數(shù)，以信噪比(S/N)等于3作為方法的檢出限，測定最低檢出限，結果如表2所示.

由表2可以看出，采用高效液相色譜法測定苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸乙酯，方法在一定范圍內，線性關系良好，相關系數(shù)均在0.999以上，方法的最低檢出限在0.065～0.601 mg/kg之間，其中對羥基苯甲酸甲酯的最低檢出濃度為0.065 mg/kg,苯甲酸的最低檢出濃度為0.601 mg/kg.

2.2.3 精密度與準確度

取不含待測組分的同一樣品，平行稱取3份樣，分別加入分高、中、低3個濃度水平的苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸甲酯以及對羥基苯甲酸乙酯的標準液.按照前處理方法進行處理，每個水平平行測定6次，測其回收率和精密度.結果如表3所示.

表2 防腐劑的液相色譜方法的線性及檢出限

表3 檢測方法的精密度和準確度

由表3可以看出，采用高效液相色譜法測定苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸乙酯，方法的平均回收率均在90%以上，其中苯甲酸的回收率較低為94.5%，對羥基苯甲酸乙酯的平均回收率最高為97.7%.相對標準偏差在1.64～2.56%之間，其中脫氫乙酸最低為1.64%，對羥基苯甲酸乙酯最高為2.56%.結果基本達到了儀器測定分析法的要求.

2.3 樣品測定結果

2.3.1 國標法測定樣品中五種防腐劑的含量

隨機抽取寶雞地區(qū)市售陳醋、啤酒、果汁、醬油、榨菜五類食品共11個樣品，分別為東湖老陳醋、海天威極老陳醋、金威啤酒、漢斯干啤、匯源橙汁、美汁源果粒橙、農夫果園、李錦記老抽、家樂特鮮醬油、口口脆榨菜、烏江牌榨菜，經前處理后，采用國標方法分別測定其中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯的含量，共測定10次，結果如表4所示.

表4 國標法測定食品中防腐劑含量

由表4可以看出，采用GB/T5009.29-2003食品中苯甲酸、山梨酸的測定方法，GB/T5009.31-2003 食品中對羥基苯甲酸酯類的測定方法，GB/T5009.121-2003食品中脫氫乙酸的測定方法，對上述樣品中的防腐劑進行測定，除東湖老陳醋含苯甲酸2.56 mg/kg，李錦記老抽含山梨酸2.95 mg/kg，家樂特鮮醬油含對羥基苯甲酸乙酯1.01 mg/kg外，其它防腐劑均未檢出.

2.3.2 高效液相色譜法測定樣品中五種防腐劑的含量

采用本文研究的高效液相色譜法同時測定寶雞地區(qū)市售陳醋、啤酒、果汁、醬油、榨菜五類食品共11個樣品中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯的含量，結果如表5所示.

由表5 可以看出，一些通過國標規(guī)定方法測定不出含有防腐劑的樣品，通過高效液相色譜同時測定法則可以測定出防腐劑的存在.如通過高效液相色譜同時測定法可以測出樣品海天威極老陳醋含有少量的苯甲酸、山梨酸及脫氫乙酸；樣品李錦記老抽除含有山梨酸外，還存在部分脫氫乙酸；樣品家樂特鮮醬油除含有對羥基苯甲酸乙酯外，還含有山梨酸、脫氫乙酸以及對羥基苯甲酸甲酯；樣品烏江牌榨菜含有脫氫乙酸及對羥基苯甲酸乙酯，而上述防腐劑由于其含量小，通過國標法均未測出，由此可見本論文研究的高效液相色譜法與國標法相比，靈敏度更高，檢測限更低，本法可以用作食品中是否含有防腐劑的定性檢測方法.

表5 高效液相色譜法同時測定食品中防腐劑含量

3 結束語

本文建立了食品中山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯這5種防腐劑的高效液相色譜測定法，并且確定了檢測方法的準確度、靈敏度、線性范圍.防腐劑檢測限在0.078～0.601 mg/L之間，回收率均在90%以上，相對標準偏差小于5%.與國家標準法相比，該法回收率高、重現(xiàn)性好、線性范圍合適，且檢測限較低，能夠實現(xiàn)對食品中這5種防腐劑同時檢測目的；實際檢測陳醋、啤酒、果汁、醬油、榨菜等食品樣品，方法回收率及重現(xiàn)性均很好.因此，作為一種分析測試方法，本法可以作為食品中是否含有以上5種防腐劑的定性判定方法，但是要作為一種通法代替國標法測定食品中防腐劑，尚需大量實驗研究及測試.

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