鄧?yán)蚶?王仁君 綜述 蘇紀(jì)平 審校

1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南寧 530021)

水楊酸鹽是臨床上常用的解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風(fēng)濕藥物，但其對(duì)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的副作用如可導(dǎo)致耳鳴、可逆性的30～40 dB的聽(tīng)力下降等仍是臨床上亟待解決的問(wèn)題。研究已發(fā)現(xiàn)，水楊酸鈉的耳毒性機(jī)制與谷氨酸受體N-甲基-D-天冬氨酸(N-metlyl-d-aspartate,NMDA)介導(dǎo)的興奮毒性有關(guān)，并且能通過(guò)內(nèi)源性Src激酶家族調(diào)節(jié)。本文就水楊酸鈉的耳蝸興奮毒性及其與Src的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 水楊酸鈉的興奮毒性

谷氨酸是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，但由于各種生理或病理原因造成谷氨酸濃度過(guò)高，過(guò)度刺激其突觸后受體，則會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，即興奮毒性。過(guò)高濃度的谷氨酸激活PA/KA受體，促進(jìn)大量Na+、Cl-和水內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞，致細(xì)胞腫脹[1]；同時(shí)，過(guò)量的谷氨酸過(guò)度激活NMDA受體，致Ca2+通道病理性開(kāi)放，引起大量Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，線粒體功能失活，自由基產(chǎn)生以及ATP能量衰竭，Caspase酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活，細(xì)胞凋亡[2]。臨床上，這種興奮毒性所造成的細(xì)胞損傷很常見(jiàn)，如急性的局部缺血、腦外傷時(shí),興奮毒性直接介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的丟失；在慢性神經(jīng)退行性疾病(如老年性癡呆、肌萎縮型側(cè)索硬化、帕金森病、亨廷頓病等)中,興奮毒性也介導(dǎo)了神經(jīng)機(jī)能異常。

水楊酸鈉是阿司匹林的主要代謝產(chǎn)物和有效成分，廣泛應(yīng)用于解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風(fēng)濕和抗血栓形成等多方面臨床治療。但在神經(jīng)系統(tǒng)，水楊酸鈉對(duì)不同狀態(tài)下的神經(jīng)元作用迥異，既有神經(jīng)保護(hù)作用，亦有神經(jīng)毒性作用。

實(shí)驗(yàn)證明，在許多情況下，水楊酸類藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有良好的神經(jīng)保護(hù)作用。Wang等[3]報(bào)道，在酸中毒的大腦皮層神經(jīng)元模型中，用膜片鉗全細(xì)胞記錄模式，可以檢測(cè)到300 μM到30 mM的水楊酸鈉或阿司匹林通過(guò)作用于酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)，能可逆性抑制ASIC電流，顯著減少酸中毒引起的皮層神經(jīng)元死亡數(shù)量，從而使大腦皮層細(xì)胞免受損傷。在原代培養(yǎng)的中腦組織中，用免疫組化染色的方法也可以觀察到0.01～1 mM阿司匹林能明顯抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LP)誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，通過(guò)檢測(cè)觀察到阿司匹林主要抑制了LP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和/或炎癥反應(yīng)，減少活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，同時(shí)促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子白介素-10(interleukin,IL-10) 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 1(transforming growth factorbeta-1,TGF- β 1)的釋放，從而保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受LP引起的神經(jīng)毒性損害[4]。此外，在NMDA造成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞興奮毒性的模型中，阿司匹林還能通過(guò)直接抑制蛋白激酶Cζ(protein kinase C zeta,PKCζ)自身裂解或在細(xì)胞核中易位而阻止其被活化，減少誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)及一氧化氮(nitric oxide,NO)的表達(dá),使視網(wǎng)膜細(xì)胞免受損傷, 發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5]。另一方面， Katz 等[6]卻報(bào)道給大鼠腹腔注射1 700 mg/kg水楊酸鈉40分鐘內(nèi)可致死大鼠，而抑制水楊酸鈉導(dǎo)致的線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換(membrane permeability transition，MPT)，能明顯延長(zhǎng)注射致死劑量水楊酸鈉的大鼠的生存時(shí)間。在PC12細(xì)胞株和大鼠耳蝸器官的培養(yǎng)中,水楊酸鈉也誘導(dǎo)了神經(jīng)細(xì)胞凋亡并呈現(xiàn)濃度依賴性[7，8]。為探討水楊酸鈉對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒副作用的機(jī)理，Gong等[9]應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，觀察水楊酸鈉對(duì)海馬CA1區(qū)興奮性突觸后電位(eld excitatory postsynaptic potentials,field EPSPs，fEPSPs)和細(xì)胞群體峰電位(population spike ，PS)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，水楊酸鈉明顯增強(qiáng)PS的峰值，卻對(duì)fEPSPs沒(méi)有明顯的影響，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)水楊酸鈉通過(guò)抑制γ-氨基丁酸(γ-aminobutvric acid,GABA)能神經(jīng)傳遞增強(qiáng)了神經(jīng)興奮性，但對(duì)基本的興奮性神經(jīng)突觸傳遞并無(wú)影響。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，水楊酸鈉作用機(jī)制的復(fù)雜性和多樣性導(dǎo)致了水楊酸鈉的不同作用表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀⑺幬飫┝?、處理時(shí)間以及體溫、營(yíng)養(yǎng)等多方面因素都能影響水楊酸鈉作用結(jié)果的變化。水楊酸鈉對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用是主要針對(duì)缺血、缺氧、酸中毒等病理?xiàng)l件而言的，主要通過(guò)抗氧化、抗炎機(jī)理，抑制NF-κB的活化等機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)。而水楊酸鈉的細(xì)胞毒性作用機(jī)制則是其自身毒性對(duì)正常細(xì)胞的損傷而言，其機(jī)制與其經(jīng)典的藥物作用機(jī)制不同，既可以直接誘導(dǎo)MPT，產(chǎn)生氧化磷酸化脫偶聯(lián)，直接促使細(xì)胞凋亡，也可通過(guò)阻斷抑制性受體功能，造成興奮性受體過(guò)度興奮，產(chǎn)生興奮毒性。

2 水楊酸鈉與耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的凋亡

谷氨酸是耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞與耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(spiral ganglion neurons，SGN)突觸的重要神經(jīng)遞質(zhì)。谷氨酸受體廣泛分布于哺乳動(dòng)物的聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)，如N-甲基-D天冬氨酸受體(N-methyl-d-aspartate receptor,NMDAR)、α-氨基-3羥基-5甲基-4異惡唑受體(al-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate receptor,AMPAR)、海人藻酸受體(kainate，KAR)在耳蝸中均有表達(dá)。

損傷性噪聲、耳蝸缺血、外傷等都可引起谷氨酸從內(nèi)毛細(xì)胞過(guò)度釋放，導(dǎo)致SGN興奮性毒性,表現(xiàn)為SGN神經(jīng)元的腫脹(空泡化)以及內(nèi)毛細(xì)胞附近樹(shù)突末梢的空泡形成，最后神經(jīng)細(xì)胞凋亡[10，11]。直接將體外培養(yǎng)的SGN暴露于高濃度的谷氨酸鹽中，亦能誘導(dǎo)SGN凋亡，并呈濃度依賴性，而應(yīng)用caspase-3阻斷劑能對(duì)抗谷氨酸鹽引起的SGN凋亡[12]。

Guitton等[13]在水楊酸鈉誘導(dǎo)的耳鳴大鼠模型中，通過(guò)圓窗在耳蝸外淋巴液中給予NMDA受體阻斷劑5-甲基二氫丙環(huán)庚烯亞胺馬來(lái)酸(dizocilpine maleate,MK-801)、7-氯犬尿酸(7-chlorokynurenic acid,7-CK)、加環(huán)利定(gacyclidine)后，觀察到大鼠的耳鳴明顯減弱，證明水楊酸鈉引起的耳鳴與耳蝸的NMDA受體有關(guān)，是水楊酸鈉興奮毒性的表現(xiàn)。迄今為止，已有許多關(guān)于水楊酸類藥物對(duì)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的毒副作用的研究，大多認(rèn)為水楊酸鈉的作用機(jī)制是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，大劑量的水楊酸類藥物損傷神經(jīng)功能可以沿著聽(tīng)覺(jué)通路，從毛細(xì)胞和初級(jí)聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)元(SGN)到大腦中樞聽(tīng)覺(jué)皮層的任一環(huán)節(jié)起作用[14～17]。毛細(xì)胞和SGN作為這個(gè)反應(yīng)的外周環(huán)節(jié)，起著重要作用。但較毛細(xì)胞而言，SGN對(duì)水楊酸鹽的毒性更敏感。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)都已證明，1 mM的水楊酸鹽即可引起顯著的SGN毒性[18]，而毛細(xì)胞則需要5～7 mM甚至更高的濃度[19],最近甚至有報(bào)道高濃度的水楊酸鈉損傷SGN，卻能增強(qiáng)毛細(xì)胞的功能[20]。盡管文獻(xiàn)報(bào)道水楊酸鹽對(duì)多種神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用[2～4]，但用水楊酸鈉直接作用于體內(nèi)或體外培養(yǎng)的SGN組織時(shí)，卻觀察到水楊酸藥物促進(jìn)了SGN的凋亡，并呈現(xiàn)出時(shí)間和劑量的依賴趨勢(shì)[8, 18, 21，22]。其具體機(jī)制目前并沒(méi)有完全明了。Jung等[8]用水楊酸鈉作用于SGN后，檢測(cè)到其細(xì)胞活性明顯降低,利用熒光染色標(biāo)記出其凋亡率明顯增高，SGN細(xì)胞上多種熱休克蛋白以及Bcl-2的表達(dá)發(fā)生了改變，為水楊酸鈉的神經(jīng)毒性作用提供了一部分病理依據(jù)。Wei等[18]亦觀察到水楊酸鈉作用后SGN呈現(xiàn)胞體萎縮、軸突縮短甚至消失的典型凋亡形態(tài)學(xué)改變，SGN上多種與凋亡相關(guān)的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)也發(fā)生了改變，推測(cè)水楊酸鈉所引起的SGN凋亡與caspase介導(dǎo)的凋亡通路有關(guān)。Feng[21，22]則用免疫組化方法驗(yàn)證了水楊酸鈉誘導(dǎo)的SGN凋亡與caspase-3有關(guān)，水楊酸鈉對(duì)SGN的興奮毒性作用是通過(guò)caspase依賴性的凋亡通路實(shí)現(xiàn)的。

3 Src家族與水楊酸鹽的興奮毒性

3.1 Src家族的結(jié)構(gòu)及功能 Src家族是一組膜結(jié)合的非受體型蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK),現(xiàn)已知Src家族包括Src、Lck、Fyn、Yes、Lyn、Hck、Fgr、Blk、Frk亞科9個(gè)成員，它們的表達(dá)有組織特異性，其中Src、Lck、Fyn、Yes、Lyn在中樞系統(tǒng)中均有高表達(dá)。Src家族成員的結(jié)構(gòu)特征是N端的豆蔻?；⒁粋€(gè)不同源的獨(dú)特結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(SH2和SH3)、一個(gè)保守的催化結(jié)構(gòu)域(又稱激酶結(jié)構(gòu)域，kinase domain,KD)和C端負(fù)調(diào)控區(qū)域。Src家族通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、繼續(xù)生存以及神經(jīng)細(xì)胞的突觸傳遞等功能，并且能影響細(xì)胞粘附、遷移和入侵的能力[23]。

3.2 Src家族對(duì)興奮毒性的調(diào)節(jié)作用 興奮毒性在細(xì)胞缺氧、外傷等病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其主要機(jī)制由NMDA受體介導(dǎo)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Src家族的一個(gè)重要作用是調(diào)節(jié)各種離子通道的活動(dòng)，如電壓門(mén)控性鉀離子通道[24]、鈣離子通道[25]、煙堿乙酰膽堿受體[26]等。 Src對(duì)NMDA受體也有明顯的調(diào)控作用，主要有以下幾個(gè)方面：①介導(dǎo)興奮毒性：XU等在大鼠大腦外傷后的病理過(guò)程中觀察到，Src通過(guò)對(duì)突觸后密度-95(postsynaptic density-95,PSD-95)酪氨酸磷酸化介導(dǎo)了興奮毒性損傷機(jī)制的啟動(dòng)和增強(qiáng)[27]。Xu等[27]也在缺血再灌注的大鼠模型中通過(guò)激活GluR5受體使Src酪氨酸磷酸化功能下降，并影響其與PSD-95、NR2A的相互作用，進(jìn)而使NMDA受體的活性下降，興奮毒性減弱；②調(diào)節(jié)突觸和突觸可塑性：在小腦顆粒細(xì)胞突觸形成過(guò)程中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)受體F1K1與NMDA受體亞基NR1和NR2B組成復(fù)合體。VEGF與F1K1結(jié)合時(shí)，通過(guò)激活Src激酶家族而使復(fù)合體中NR2B磷酸化增強(qiáng)，NMDA 受體電流和Ca2+內(nèi)流(Ca2+influx)增大，這種增大的Ca2+內(nèi)流能促進(jìn)小腦顆粒細(xì)胞遷移，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的突觸形成起重要作用[28]；③易化痛覺(jué)感受：在用鞘內(nèi)注射NMDA構(gòu)建的痛覺(jué)過(guò)敏的大鼠模型上，鞘內(nèi)注射Src激酶抑制劑PP2能阻止NR2B受體亞基的酪氨磷酸化，減弱NMDA誘導(dǎo)的NR2B受體突觸表達(dá)，使大鼠的機(jī)械觸感的敏感性下降，痛覺(jué)敏感性降低[29]；④介導(dǎo)藥物成癮：在可卡因成癮的小鼠模型中，Src激酶誘導(dǎo)的NMDA受體亞單位NR2B酪氨酸磷酸化，促進(jìn)了細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK) 激活，導(dǎo)致了可卡因成癮的發(fā)生[30]。

Src激酶家族調(diào)控NMDA受體的主要證據(jù)有：①Src家族通過(guò)SH2和SH3區(qū)域與NMDA受體結(jié)合，應(yīng)用聯(lián)合免疫沉淀法可標(biāo)志出Src是NMDA受體蛋白的組成部分，并集中在突觸后密度處(postsynaptic density，PSD)[26]；②Src家族激活后，能促使NR2A、NR2B磷酸化，增強(qiáng)NMDA 受體功能。用抗磷酸化抗體標(biāo)記NR2A和NR2B受體發(fā)現(xiàn)，活體大鼠海馬細(xì)胞中約有2.1%NR2A受體亞基和3.6%NR2B受體亞基是被酪氨酸磷酸化的。在NR2A受體亞基中，已發(fā)現(xiàn)多個(gè)c-Src的磷酸化作用位點(diǎn)：Tyr-1292、Tyr-1325和Tyr-1387。 Src通過(guò)這些作用位點(diǎn)使受體亞基酪氨酸磷酸化，阻止Zn2+依賴性抑制作用對(duì)NMDA受體的抑制作用，增加NMDA受體的活性而上調(diào)NMDA受體功能[31]；③應(yīng)用細(xì)胞電生理技術(shù)，在細(xì)胞中添加Src或能激活Src家族成員的相關(guān)肽，能增強(qiáng)NMDA受體單通道活動(dòng)，提高NMDA誘導(dǎo)的電流和NMDA受體參與組成的興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic currents，EPSCs)；這種增強(qiáng)了的NMDA受體活動(dòng)能被特異性Src阻斷劑阻斷[32]。

研究表明，NMDA受體電流調(diào)控由酪氨酸磷酸化和去磷酸化來(lái)保持平衡：抑制內(nèi)源性Src活動(dòng)或添加外源性的蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTP)能抑制NMDA受體功能[33]；反之，應(yīng)用PTP抑制劑抑制內(nèi)源性的PTP活動(dòng)或添加外源性Src，能增強(qiáng)NMDA受體功能[34]。

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)Src家族對(duì)興奮毒性的調(diào)節(jié)機(jī)制可能有:①Src 家族是NMDA受體蛋白的組成部分;②Src 調(diào)控NMDA受體的磷酸化。

3.3 Src家族與水楊酸鈉 在非神經(jīng)細(xì)胞中觀察到了水楊酸鈉能抑制Src活性[35，36]。Wang等[35]用免疫沉淀和免疫印跡法在體外培養(yǎng)的心肌中觀察到水楊酸鈉能抑制血管緊張素或血小板衍生生長(zhǎng)因子激活c-Src。應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)Ca2+螯合劑或蛋白激酶C抑制劑能減弱水楊酸鈉對(duì)Src磷酸化的抑制作用，表明水楊酸鈉對(duì)Src活性的抑制作用機(jī)制是Ca2+和蛋白激酶C依賴性的。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)水楊酸鈉對(duì)Src活性的抑制作用在濃度為5～20 mM時(shí)最明顯，并呈現(xiàn)出濃度依賴性，即水楊酸鈉濃度越高其對(duì)Src磷酸化的抑制作用越強(qiáng)。而 Perez等[36]發(fā)現(xiàn)在單核細(xì)胞中，水楊酸鈉只有在20 mM的濃度時(shí)才對(duì)Src磷酸化起一定的作用，而低于這個(gè)濃度是沒(méi)有作用的。但在神經(jīng)細(xì)胞的研究中，仍未見(jiàn)水楊酸鈉與Src的關(guān)系的報(bào)道。

4 結(jié)語(yǔ)

磷酸化對(duì)NMDA受體的調(diào)控是一系列影響因子作用的結(jié)果，在興奮毒性過(guò)程中起關(guān)鍵作用，通過(guò)調(diào)節(jié)NMDA受體磷酸化，尤其是通過(guò)調(diào)節(jié)Src功能而減少興奮毒性的危害將是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的一個(gè)新的切入點(diǎn)。目前，Src對(duì)于水楊酸鈉耳毒性是否具有調(diào)節(jié)作用仍未見(jiàn)報(bào)道，如何通過(guò)調(diào)節(jié)其自身受體磷酸化狀態(tài)來(lái)影響興奮毒性過(guò)程而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞是目前亟需進(jìn)一步研究的課題,以期為防治許多內(nèi)耳疾病提供新的理論依據(jù)。

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