張超，單麗偉，蘇帥坤，南艷妮，郭忠玉，范三紅

1 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100

2 西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，陜西 楊凌 712100

過氧化物酶廣泛存在于植物界，它們參與植物激素代謝、細(xì)胞延伸、木質(zhì)素和軟木脂形成、細(xì)胞壁組分交聯(lián)及逆境響應(yīng)等重要生理及發(fā)育過程[1]。同時(shí)，植物過氧化物酶也作為重要的商品酶應(yīng)用于生物催化、臨床檢測(cè)和生物技術(shù)研究等領(lǐng)域[2-3]。小麥種子過氧化物酶 1 (Wheat peroxidase 1，WP1) 屬于含血紅素的Ⅲ型植物過氧化物酶，其以 H2O2為電子受體催化多種芳香族化合物的氧化。該酶具有抗真菌活性，可抑制病原真菌芽管的伸長(zhǎng)[4]；同時(shí)該酶的存在對(duì)面粉加工性能有重要影響[5-8]。利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)植物過氧化物酶已有一些報(bào)道，如辣根過氧化物酶HRP C、蕪青根過氧化物酶BnPA、煙草陰離子過氧化物酶TOP、楊樹細(xì)胞壁陽離子過氧化物酶CWPO_C[9-12]，但重組蛋白均主要以包涵體的形式存在，只有經(jīng)過變性復(fù)性才能獲得具有部分活性的酶蛋白。本研究組曾嘗試?yán)么竽c桿菌系統(tǒng)表達(dá) WP1，雖然通過融合麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP) 標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)了重組WP1的可溶性表達(dá)，但仍只能檢測(cè)到微弱的過氧化物酶活性[13-14]。導(dǎo)致上述結(jié)果可能有兩個(gè)原因：一是大腸桿菌血紅素合成量不能滿足需求，導(dǎo)致大部分蛋白以脫輔基形式存在；二是肽鏈不能正確折疊，二硫鍵不能正確形成，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白以包涵體形式存在。

關(guān)于增加大腸桿菌菌體內(nèi)血紅素的累積已有很多報(bào)道，根據(jù)原理可分為兩種策略。第一種策略通過外加血紅素、提高血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)能力實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)血紅素的累積。1994年Rosenthal研究組在培養(yǎng)基中加入外源血紅素，發(fā)現(xiàn)血紅素具有一定的穿透性，但不同的菌種有差異，JM109菌株具有較好的穿透性[15]。2004年，Varnado研究組，將大腸桿菌血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)基因ChuA和過氧化氫酶基因kat共表達(dá)，在外加血紅素的條件下，實(shí)現(xiàn)了過氧化氫酶在大腸桿菌中的大規(guī)模表達(dá)[16]。2008 年，Graves等將類志賀鄰單胞菌Plesiomonas shigelloides中血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因hugA、hugB、hugC/D與血紅蛋白基因共表達(dá)，在外加血紅素的條件下，全蛋白的表達(dá)顯著增加[17]。第二種策略則是通過過量表達(dá)血紅素合成途徑中限速酶的基因?qū)崿F(xiàn)內(nèi)源血紅素的累積。2006年，何曉梅等將面包酵母 5-氨基酮戊酸合酶 (ALAS) 的基因?qū)氪竽c桿菌，促進(jìn)了大腸桿菌中血紅素的累積，且胞外濃度高于胞內(nèi)濃度[18]。2006年，王俊卿等將類球紅細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides AlAS的基因?qū)氪竽c桿菌，導(dǎo)致血紅素前體5-氨基乙酰丙酸 (5-ALA)在大腸桿菌中累積，但其表達(dá)受C4合成途徑前體甘氨酸的限制，需要在培養(yǎng)基中外加20 mmol/L的甘氨酸[19]。2010年，Sudhamsu等將亞鐵螯合酶基因 (FC) 和芽胞桿菌一氧化氮合成酶基因(gsNOS) 共表達(dá)，在外加25 mg/L 5-ALA條件下，促進(jìn)了完整的血紅蛋白的形成，從而達(dá)到提高含血紅素輔基蛋白酶活力的目的[20]。但這些報(bào)道中大多使用了外源的血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)或合成相關(guān)基因，而且需要外加血紅素或者血紅素合成的前體物質(zhì) (5-ALA或甘氨酸)。

大腸桿菌血紅素合成采用C5途徑，以谷氨酰tRNA為前體，經(jīng)過7個(gè)中間產(chǎn)物最終形成血紅素。該合成途徑的第一步，即由谷氨酰tRNA合成5-ALA的反應(yīng)是限速步驟，該步驟由hemA和 hemL基因編碼的谷氨酰 tRNA還原酶(GluTR，HemA) 和谷氨酸半醛變位酶 (GSAM，HemL) 催化[21]。本研究擬過表達(dá)大腸桿菌自身的hemA和hemL基因，提高細(xì)胞內(nèi)血紅素含量，并在此基礎(chǔ)上導(dǎo)入小麥過氧化物酶基因WP1，增強(qiáng)WP1在原核系統(tǒng)中的功能性表達(dá)。該研究不僅有利于WP1的深入研究與利用，也為其他植物Ⅲ型過氧化物酶超家族成員的活性表達(dá)和功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌菌株Turbo、T7 Express為NEB公司產(chǎn)品，OrigamiTMB (DE3) 為Novagen公司產(chǎn)品；克隆載體pMD?19-T 購自TaKaRa公司，雙基因共表達(dá)載體pACYCDuet-1為Novagen公司產(chǎn)品；包含小麥過氧化物酶基因WP1的MBP融合表達(dá)載體 pET21a-MBP-WP1和 pMAL-p4x-WP1由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 工具酶和試劑

PrimeSTAR?HS DNA聚合酶、T4 DNA 連接酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒DNA小量試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；限制性內(nèi)切酶Nco Ⅰ、BamHⅠ、NdeⅠ、XhoⅠ和NotⅠ，Amylose resin、2-Log DNA Ladder、protein marker均為 NEB公司產(chǎn)品；2,2’-聯(lián)氮-二 (3-乙基苯并噻唑-6-磺酸) 二銨鹽 (ABTS) 和氨基乙酸丙酸鹽 (5-ALA·HCl) 購自Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 hemA和hemL基因的克隆

利用細(xì)菌基因組DNA小量制備法[22]，從大腸桿菌中提取其基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳及分光光度法檢測(cè) (EVOLUTION 300，Thermo)基因組DNA的完整性和質(zhì)量。參考GenBank中大腸桿菌 K12基因組序列 (Accession No. NC_010473) 設(shè)計(jì)用于hemA和hemL基因擴(kuò)增的特異性引物，具體序列見表1，其中下劃線代表的酶切位點(diǎn)依次為 NcoⅠ、BamHⅠ、NdeⅠ、XhoⅠ，框選部分代表 hemL中的 NdeⅠ突變位點(diǎn)。以大腸桿菌基因組DNA為模板，使用特異引物hemA-f和hemA-r通過PCR擴(kuò)增獲得hemA；為了將hemL基因中NdeⅠ切點(diǎn)進(jìn)行同義突變，通過兩步 PCR法獲得 hemL，以 hemL-f和hemL-mr為引物擴(kuò)增獲得的片段為 hemL1，以hemL-mf和 hemL-r為引物擴(kuò)增獲得的片段為hemL2；最后以回收的hemL1和 hemL2為模板，hemL-f和 hemL-r為引物擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)hemL。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收純化目的條帶，純化產(chǎn)物連接到pMD?19-T載體上，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株 Turbo感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆，重組質(zhì)粒命名為pMD?19-T-A，pMD?19-T-L，送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

pMD?19-T-A經(jīng)NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切獲得的 hemA片段與用相同酶切的 pACYCDuet-1連接，獲得的重組質(zhì)粒命名為 pACYC-A；pMD?19-T-L經(jīng) NdeⅠ和 XhoⅠ雙酶切獲得的hemL片段與用相同酶切的pACYCDuet-1連接，獲得的重組質(zhì)粒命名為pACYC-L。pACYC-L經(jīng)NotⅠ和XhoⅠ雙酶切獲得的hemL片段插入經(jīng)相同酶切的pACYC-A載體，獲得重組質(zhì)粒命名為pACYC-A-L。

1.2.3 HemA和HemL蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)

分別將已構(gòu)建好的3種重組質(zhì)粒pACYC-A、pACYC-L及pACYC-A-L轉(zhuǎn)入大腸桿菌T7 Express感受態(tài)細(xì)胞，將陽性單克隆接種于含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，按 1∶100的比例接種到50 mL的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期 (OD=0.4~0.6)，加入 IPTG (終濃度為0.5 mmol/L)，28 ℃誘導(dǎo) 6 h后，收集菌體。用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 重懸菌體，超聲波破碎細(xì)胞，4 ℃，12 000 r/min離心5 min。使用15% SDS-PAGE檢測(cè)總蛋白和裂解后的菌液上清。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.4 5-ALA含量的測(cè)定

參考 Mauzerall的方法[23]測(cè)定培養(yǎng)液中5-ALA的含量。對(duì)照菌 (T7 Express/pACYCDuet-1)及重組菌 (T7 Express/pACYC-A、T7 Express/ pACYC-L和T7 Express/pACYC-A-L) 28 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)，在6、8、10、12 h分別取2 mL培養(yǎng)液，向離心后的上清中加入0.5 mL乙酰丙酮和1 mL的 2 mol/L的乙酸鈉緩沖液 (pH 4.6)，沸水浴15 min，冷卻至室溫后，加入埃利希氏 (Ehrlich’s)顯色劑[24]，顯色 30 min，用分光光度計(jì)檢測(cè)554 nm光吸收。以5-ALA·HCl為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算5-ALA的含量。

1.2.5 卟啉類物質(zhì)的定性檢測(cè)

卟啉類化合物的測(cè)定參考臨床化學(xué)診斷方法大全一書[25]。取15 mL誘導(dǎo)后菌液上清和5 mL冰乙酸：乙酸乙酯 (HAc-EtAc，1∶4) 于離心管中，劇烈振蕩離心至有機(jī)相與水相分離，小心地將有機(jī)相吸出，移至另一試管，加入3 mol/L HCl 2.5 mL，劇烈振蕩，卟啉類物質(zhì)被抽提到下面的鹽酸層。將抽提液進(jìn)行波長(zhǎng)掃描 (350~800 nm)，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.6 融合蛋白的表達(dá)與純化

將包含 WP1基因的兩種融合表達(dá)載體pMAL-p4x-WP1和 pET21a-MBP-WP1分別與pACYC-A-L共轉(zhuǎn)入大腸桿菌T7 Express感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)，將兩載體單轉(zhuǎn)入該菌株，作為對(duì)照組。利用含有氨芐青霉素 (50 μg/mL) 和氯霉素(34 μg/mL) 兩種抗生素的LB平板篩選同時(shí)包含兩種質(zhì)粒的陽性菌株，其中 pMAL-p4x-WP1和 pET21a-MBP-WP1為氨芐抗性，pACYC-A-L為氯霉素抗性。蛋白表達(dá)具體過程參見1.2.3，收集到的菌體用低鹽緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)，100 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA (pH 8.0) 重懸，超聲波破碎細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心5 min。將離心后的上清液載入Amylose親和層析柱，依次用20倍柱體積低鹽緩沖液，30倍柱體積高鹽緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)，500 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA (pH 8.0))，20倍柱體積低鹽緩沖液洗柱，最后用洗脫緩沖液 (含 5 g/L麥芽糖的低鹽緩沖液)，獲得MBP-WP1 融合蛋白。然后用 15% SDS-PAGE檢測(cè)總蛋白和純化后的蛋白，并通過考馬斯亮藍(lán)G-250顯色與標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線比較，計(jì)算純化的MBP-WP1濃度。

1.2.7 融合蛋白MBP-WP1的活性檢測(cè)

以ABTS為底物，檢測(cè)融合蛋白MBP-WP1的過氧化物酶活性[26]：在 25 ℃，將純化到的MBP-WP1加入到1 mL反應(yīng)體系中，使其終濃度為0.01 g/L，體系包括2.5 mmol/L ABTS、2 mmol/L H2O2、5 mmol/L CaCl2、50 mmol/L pH 5.0的HAc-NaAc。使用紫外可見分光光度儀檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物在405 nm 的光吸收。

2 結(jié)果與分析

2.1 hemA和hemL基因的擴(kuò)增

以大腸桿菌基因組DNA為模板，使用特異引物hemA-f和hemA-r擴(kuò)增獲得hemA基因片段，擴(kuò)增結(jié)果見圖1 (泳道1)，與預(yù)期大小1 257 bp相當(dāng)。因后續(xù)克隆過程中要使用內(nèi)切酶NdeⅠ，因而在擴(kuò)增 hemL基因時(shí)，通過兩步PCR法將基因內(nèi)部的 NdeⅠ切點(diǎn)進(jìn)行了同義突變(T1152/C1152)。hemL-f和hemL-mr擴(kuò)增片段hemL1(1 163 bp)、hemL-mf和hemL-r擴(kuò)增片段hemL2(115 bp) 及兩者重疊延伸獲得的全長(zhǎng) hemL (1 278 bp) 如圖1中3、4和2泳道所示。擴(kuò)增片段連接到pMD?19-T載體，測(cè)序結(jié)果顯示克隆的序列與設(shè)計(jì)完全一致。

圖1 大腸桿菌hemA、hemL 基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 Amplification of hemA and hemL of E. coli by PCR. M: 2-Log DNA ladder; 1: hemA gene; 2: hemL gene; 3: hemL1; 4: hemL2.

2.2 包含hemA和hemL表達(dá)載體的構(gòu)建

將 hemA、hemL分別連入表達(dá)載體pACYCDuet-1獲得重組載體 pACYC-A 和pACYC-L；pACYC-L經(jīng)NotⅠ和XhoⅠ雙酶切獲得hemL片段，將其連入經(jīng)相同酶切的pACYC-A獲得雙基因重組載體 pACYC-A-L，三者結(jié)構(gòu)如圖2A所示。3種重組載體雙酶切鑒定結(jié)果如圖2B所示，pACYC-A和pACYC-L雙酶切后均獲得兩個(gè)條帶，一條是與對(duì)照 (泳道 1) 一致的空載體，另一條則是與預(yù)期一致的目的基因。重組載體pACYC-A-L經(jīng)NotⅠ、XhoⅠ雙酶切獲得與預(yù)期大小一致的5 kb和1.4 kb的兩個(gè)條帶。酶切驗(yàn)證后的載體進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確證無誤后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 HemA和HemL在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

圖2 重組質(zhì)粒示意圖及載體酶切鑒定結(jié)果Fig. 2 Construction and confirmation of recombination vectors. (A) Diagram of recombination vectors. (B) Confirmation of recombination vectors by double digestion. M: 2-Log DNA ladder; 1: pACYCDuet-1 digested with Nco Ⅰ and BamHⅠ; 2: pACYC-A digested with NcoⅠand BamHⅠ; 3: pACYC-L digested with NdeⅠand XhoⅠ; 4: pACYC-A-L digested with NotⅠand XhoⅠ.

圖3 SDS-PAGE分析HemA和HemL在大腸桿菌中的過量表達(dá)Fig. 3 Over-expression of HemA and HemL in E. coli analyzed by SDS-PAGE. 1?3: protein of T7 Express/ pACYC-A; 4?6: protein of T7 Express/pACYC-L; 7?9: protein of T7 Express/pACYC-A-L; M: protein marker; 1,4,7: un-induced control; 2,5,8: total protein after inducing; 3,6,9: soluble protein after inducing.

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pACYC-A、pACYC-L和pACYC-A-L，分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌T7 Express感受態(tài)細(xì)胞，28 ℃誘導(dǎo)后的菌體總蛋白和可溶性蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果如圖3所示。從電泳圖中可看出，HemA和HemL均獲得高效過量表達(dá)，且目的蛋白均以可溶性形式存在。單獨(dú)過量表達(dá)HemA或HemL時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白的50%以上；而同時(shí)過量表達(dá)HemA和HemL，目的蛋白的表達(dá)量則僅占菌體總蛋白的20%左右。這可能是由于兩蛋白同時(shí)過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致血紅素合成途徑中間產(chǎn)物的過量累積，而這些物質(zhì)的累積影響了宿主菌的生長(zhǎng)和蛋白合成。另外需要說明的是，hemA和hemL基因長(zhǎng)度僅差21 bp，表達(dá)的蛋白相差不到 1 kDa，15%的SDS-PAGE不能很好地將它們分離，因此，共表達(dá)時(shí)只能看到一條重疊的蛋白條帶。

2.4 5-ALA含量的測(cè)定

對(duì)照菌 (T7 Express/pACYCDuet-1) 及重組菌 (T7 Express/pACYC-A、T7 Express/pACYC-L和T7 Express/pACYC-A-L) 經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間后，分別對(duì)它們離心后的培養(yǎng)液中的5-ALA含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖4。由圖知：誘導(dǎo)12 h后，T7 Express/pACYC-A-L培養(yǎng)液中5-ALA含量高達(dá) 146.73 mg/L，對(duì)照菌中僅為7.27 mg/L, 而 T7 Express/pACYC-A 和T7 Express /pACYC-L培養(yǎng)液中的5-ALA含量分別為：9.67 mg/L、9.54 mg/L。雖然，T7 Express/ pACYC-A和T7 Express/pACYC-L相比于對(duì)照菌培養(yǎng)液中的 5-ALA的含量略有增加，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于重組菌T7 Express/pACYC-A-L，說明HemA、HemL同時(shí)表達(dá)要比它們單獨(dú)表達(dá)更利于大腸桿菌5-ALA的合成，為血紅素合成提供更多的前體。

2.5 卟啉類物質(zhì)定性檢測(cè)

重組菌 T7 Express/pACYC-A-L 通 過0.5 mmol/L IPTG，28 ℃誘導(dǎo)后，菌體和培養(yǎng)液均呈淡粉紅色，而對(duì)照菌 T7 Express/ pACYCDuet-1無此現(xiàn)象。Piao等報(bào)道[27]，尿卟啉原是無色的，但它氧化產(chǎn)生的卟啉類物質(zhì)在400~405 nm 處有光吸收，因而可以利用400~405 nm的光吸收判斷培養(yǎng)液中卟啉類化合物的含量。波長(zhǎng)掃描結(jié)果 (圖 5) 發(fā)現(xiàn)重組菌T7 Express/pACYC-A-L的培養(yǎng)液在403 nm處有明顯的光吸收，吸收值達(dá) 0.50，重組菌T7 Express/pACYC-A的培養(yǎng)液也有微弱的光吸收，而對(duì)照菌T7 Express/pACYCDuet-1和重組菌T7 Express/pACYC-L則沒有明顯的光吸收。此結(jié)果與 5-ALA含量的測(cè)定結(jié)果相吻合，說明 5-ALA含量越高，則卟啉類化合物含量也越高。

圖4 重組菌和對(duì)照菌培養(yǎng)液中5-ALA的含量Fig. 4 5-ALA concentration of the culture solution of the recombinant strain and comparative strain.

圖5 重組菌與對(duì)照菌培養(yǎng)液提取物光吸收掃描Fig. 5 Wavelength scan of the culture extraction of the recombinant strain and comparative strain.

2.6 融合蛋白的表達(dá)與純化

將融合表達(dá)載體pMAL-p4x-WP1和pET21a-MBP-WP1分別與重組載體pACYC-A-L共同轉(zhuǎn)入大腸桿菌 T7 Express感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)分別將它們單獨(dú)轉(zhuǎn)入此菌株，作為對(duì)照。各種重組菌的菌體總蛋白、可溶性蛋白及從中純化獲得的MBP-WP1融合蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果如圖6A和6B所示。從圖6A可以看到，融合表達(dá)載體 pMAL-p4x-WP1與重組載體pACYC-A-L共轉(zhuǎn)入 T7 Express后，MBP-WP1部分以可溶性蛋白形式存在，但是表達(dá)量比pMAL-p4x-WP1單轉(zhuǎn)受體菌低；從圖6B可以看出，pET21a-MBP-WP1與pACYC-A-L共轉(zhuǎn)后，MBP-WP1的表達(dá)量同樣低于其單轉(zhuǎn)受體菌，而且蛋白可溶性下降。共轉(zhuǎn)化菌株中MBP-WP1表達(dá)量的下降可能是其與HemA和HemL競(jìng)爭(zhēng)菌體內(nèi)蛋白合成資源所致。

圖6 MBP-WP1融合蛋白表達(dá)及純化的SDS-PAGE分析Fig. 6 Expression and purification of fusion protein MBP-WP1 analyzed by SDS-PAGE. (A) Expression of MBP-WP1 in T7 Express/pMAL-p4x-WP1 (5?8) and T7 Express/(pMAL-p4x-WP1+pACYC-A-L) (1?4). M: protein marker; 4,8: un-induced control; 3,7: total protein after inducing; 2,6: soluble protein after inducing; 1,5: purified MBP-WP1. (B) Expression of MBP-WP1 in T7 Express/pET21a-MBP-WP1 (1?4) and T7 Express/ (pET21a-MBP-WP1+pACYC-A-L) (5?8). M: protein marker; 1,5: un-induced control; 2,6: total protein after inducing; 3,7: soluble protein after inducing; 4,8: purified MBP-WP1.

2.7 融合蛋白MBP-WP1的活性檢測(cè)

以ABTS為底物測(cè)定融合蛋白MBP-WP1的過氧化物酶活性，1 mL的測(cè)活體系中MBP-WP1的終濃度為0.01 g/L，從不同菌株中分離純化獲得的融合蛋白的催化能力測(cè)定結(jié)果如圖7所示。圖中縱坐標(biāo)為酶促反應(yīng)速率，用每分鐘內(nèi)反應(yīng)液在405 nm吸光度值的變化量表示；橫坐標(biāo)為利用不同表達(dá)體系純化獲得的4種融合蛋白。非分泌型表達(dá)載體 pET21a-MBP-WP1單獨(dú)轉(zhuǎn)入大腸桿菌T7 Express獲得的MBP-WP1融合蛋白的過氧化物酶活性與它和重組載體pACYC-A-L共轉(zhuǎn)后MBP-WP1的活性相比，幾乎沒有變化，而同條件下分泌型表達(dá)載體 pMAL-p4x-WP1與重組載體pACYC-A-L共轉(zhuǎn)后 MBP-WP1的活性是pET21a-MBP-WP1單獨(dú)轉(zhuǎn)化的14.6倍，說明分泌表達(dá)和提高內(nèi)源血紅素含量均可增強(qiáng)重組WP1的活性表達(dá)。另外，分泌表達(dá)有利于蛋白的正確折疊和二硫鍵的正確形成，如果蛋白不能正確折疊，即便有充足的血紅素，重組WP1的比活力也無明顯變化。

圖7 不同重組菌株MBP-WP1過氧化物酶活力比較Fig. 7 Comparison of the peroxidase activity of MBPWP1 from different recombinant strains. a: T7 Express/ pET21a-MBP-WP1; b: T7 Express/(pET21a-MBPWP1+pACYC-A-L); c: T7 Express/pMAL-p4x-WP1; d: T7 Express/ (pMAL-p4x-WP1+ pACYC-A-L).

3 討論

WP1是典型的植物Ⅲ型分泌型過氧化物酶，這類酶通常以單體形式存在，包含1個(gè)血紅素分子和8個(gè)保守的半胱氨酸殘基，因而血紅素能否正確結(jié)合及二硫鍵能否正確形成是影響該蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中功能性表達(dá)的2個(gè)核心問題。大腸桿菌hemA和hemL基因分別編碼GluTR和GSAM，它們催化了以谷氨酰tRNA為底物形成5-ALA的反應(yīng)，該反應(yīng)是細(xì)菌血紅素合成的限速步驟。本研究將單獨(dú)包含hemA或hemL基因的重組質(zhì)粒pACYC-A或pACYC-L，及同時(shí)包含兩基因的重組質(zhì)粒 pACYC-A-L導(dǎo)入宿主菌，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示三者均出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的目標(biāo)蛋白條帶 (圖 3)，由于 HemA和HemL 分子量非常接近，無法判斷導(dǎo)入pACYC-A-L后出現(xiàn)的目標(biāo)條帶是HemA、HemL或兩者的重疊條帶。但與分別導(dǎo)入hemA或hemL的菌株相比，同時(shí)導(dǎo)入hemA和hemL后，去除菌體后的培養(yǎng)液中 5-ALA的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前兩者 (圖4)，因而可以推斷，導(dǎo)入pACYC-A-L后宿主菌中的hemA和hemL同時(shí)實(shí)現(xiàn)了過表達(dá)，并可將培養(yǎng)基中游離 5-ALA的含量提高到146.73 mg/L。5-ALA累積并不代表血紅素的累積，為了進(jìn)一步確認(rèn)卟啉類化合物是否增加，本研究測(cè)定了培養(yǎng)液在403 nm的光吸收。與對(duì)照菌株、導(dǎo)入pACYC-A或pACYC-L的菌株相比，導(dǎo)入pACYC-A-L后菌落及培養(yǎng)液呈粉紅色，且培養(yǎng)液中卟啉類物質(zhì)大量累積，該結(jié)果與前面測(cè)定的不同菌株培養(yǎng)液中 5-ALA的累積量一致。上述結(jié)果表明，同時(shí)過量表達(dá)hemA和hemL可顯著提高大腸桿菌5-ALA、血紅素及其他卟啉類化合物的生物合成。

然而，充足的血紅素并不能保證表達(dá)的蛋白一定具有生物學(xué)功能，肽鏈的正確折疊、二硫鍵的正確形成同樣非常關(guān)鍵。二硫鍵未形成或錯(cuò)誤形成都會(huì)導(dǎo)致這些蛋白積聚形成包涵體，或者導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)松散而被降解[28]，而先前利用原核系統(tǒng)表達(dá)許多過氧化物酶時(shí)目標(biāo)蛋白通常形成包涵體的現(xiàn)象便是最好的佐證。大腸桿菌胞質(zhì)是高度還原的介質(zhì)，不利于二硫鍵的形成和穩(wěn)定；而外周質(zhì)中包含促進(jìn)二硫鍵形成的二硫鍵氧化還原酶 (DsbA，DsbB，DsbC等) 和促進(jìn)肽鏈正確取向的肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶 (PPIase)，因而將胞質(zhì)中不能正確折疊的富半胱氨酸殘基蛋白分泌到外周質(zhì)，則可獲得部分或全部生物活性[29-31]。本實(shí)驗(yàn)用到了包含 WP1基因的分泌型表達(dá)載體 pMAL-p4x-WP1和非分泌型表達(dá)載體pET21a-MBP-WP1，由圖7可知，利用分泌型載體獲得的重組WP1的活力約為非分泌型載體的7.5倍。事實(shí)上也有商業(yè)化可增強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵正確折疊的菌株，如 Novagen公司的OrigamiTM系列菌株和NEB公司的Shuffle?系列菌株，這些菌株均可提高細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵的正確折疊。我們也曾將 pMAL-p4x-WP1和 pET21a-MBP-WP1導(dǎo)入OrigamiTMB (DE3) 菌株，但獲得的重組WP1的活力與pMAL-p4x-WP1導(dǎo)入常規(guī)的表達(dá)菌株T7 Express時(shí)相當(dāng)。由于WP1和其他Ⅲ型植物過氧化物酶均為分泌型蛋白，直接將這類過氧化物酶分泌到外周質(zhì)比使用商業(yè)化菌株更便捷。將pACYC-A-L與pMAL-p4x-WP1共轉(zhuǎn)后，重組WP1的過氧化物酶活性是單獨(dú)轉(zhuǎn)化pMAL-p4x-WP1的2倍，是單獨(dú)轉(zhuǎn)化pET21a-MBP-WP1的14.6倍，說明通過過表達(dá)hemA和hemL增加內(nèi)源血紅素水平、通過分泌表達(dá)促進(jìn)肽鏈正確折疊和二硫鍵正確形成均可提高 WP1在原核系統(tǒng)中的功能性表達(dá)，而且兩種效應(yīng)可以疊加。將pACYC-A-L與非分泌型載體pET21a-MBP-WP1共轉(zhuǎn)化宿主菌，獲得的重組WP1的過氧化物酶活性與單獨(dú)轉(zhuǎn)化pET21a-MBP-WP1相比，活力沒有明顯的變化，說明即便有充足的血紅素，如果蛋白不能正確折疊，則血紅素不能正確結(jié)合，酶活性也無法提高。上述結(jié)果從正反兩方面說明，血紅素和酶蛋白的正確結(jié)合是 WP1功能性表達(dá)的關(guān)鍵。

植物Ⅲ型過氧化物酶家族成員眾多，它們不僅在植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要功能，而且在工業(yè)領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值，然而利用大腸桿菌表達(dá)該類酶時(shí)目標(biāo)蛋白通常以無活性的包涵體形式存在。本研究在不外加血紅素、5-ALA或甘氨酸的條件下，通過過表達(dá)hemA和hemL提高胞內(nèi)血紅素水平、融合MBP增溶、分泌到外周質(zhì)促進(jìn)正確折疊等策略，實(shí)現(xiàn)了小麥種子過氧化物酶WP1的功能性表達(dá)，為WP1進(jìn)一步的功能研究和開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。該研究為植物Ⅲ型過氧化物酶在大腸桿菌中的表達(dá)提供了一個(gè)可行的方案，同時(shí)也為其他具有重要生物學(xué)功能的血紅素輔基蛋白的活性表達(dá)提供了有益參考。

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