張艷，吳家和，何朝族

1 清華大學生命科學學院，北京 100084

2 清華大學深圳研究生院，廣東 深圳 518055

3 中國科學院微生物研究所 植物基因組國家重點實驗室，北京 100101

4 海南大學 海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室，海南 ?？?570228

根系的形態(tài)建成是高度可塑的，環(huán)境條件可以對其產(chǎn)生不同程度的影響。但是根系如何響應(yīng)各種環(huán)境因素 (例如營養(yǎng)供給)，尚沒有闡釋清楚。植物的根對外源糖分的吸收和利用是其中一個重要研究內(nèi)容，目前已有一些進展。已有報道紅甜菜Beta vulgaris L.在毛狀根生長期間對蔗糖進行吸收利用，發(fā)現(xiàn)在最初的3 d里，隨著毛狀根的生長，培養(yǎng)基中蔗糖的濃度逐漸降低，表明外源蔗糖可被根部細胞吸收[1]。擬南芥苗的地上組織與生長培養(yǎng)基中蔗糖的直接接觸，對促進側(cè)根原基的發(fā)育具有重要影響[2]。根感應(yīng)到輕度的滲透脅迫后，減少了對外源蔗糖的吸收，從而導致側(cè)根形成的抑制[2]。水稻根對外源糖分的吸收和響應(yīng)尚未見報道。

不同生物 (包括植物) 利用水孔蛋白這一類膜蛋白協(xié)助水分跨膜運輸[3]。植物水孔蛋白形成一個大的蛋白家族，主要包括質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(PIP) 類和液泡膜內(nèi)在蛋白 (TIP) 類[4]。已有報道PIP類水孔蛋白參與了葡萄根水分傳輸，能夠響應(yīng)晝夜和干旱脅迫[5]。當處于鹽脅迫時，大麥根中由PIP類水孔蛋白介導的水分運輸通過磷酸化作用被調(diào)控[6]。OsPIP2;4和OsPIP2;5是水稻中的2個水孔蛋白基因，在根中的轉(zhuǎn)錄水平都呈現(xiàn)出明顯的晝夜波動，光照3 h后出現(xiàn)一個峰值，黑暗3 h后出現(xiàn)一個最低值[4]。此外，冷處理后OsPIP2;4和 OsPIP2;5在根中的表達均顯著降低，當溫度回升后表達水平又恢復，呈現(xiàn)出溫度波動[4]。這些結(jié)果指出當根部水分吸收隨晝夜和溫度變化，OsPIP2;4和OsPIP2;5的轉(zhuǎn)錄水平也隨之變化。根吸收外源糖分后會導致一定程度的滲透脅迫。這是否會影響到水稻根中水孔蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平是本研究內(nèi)容之一。

我們以前鑒定了一個水稻突變體 ospk1，主要表型有矮化、鞘包穗和結(jié)實率下降[7]。單拷貝的T-DNA片段插入到OsPK1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，導致突變體中OsPK1的轉(zhuǎn)錄水平下降了90%，從而引起上述突變表型。OsPK1編碼一個在胞質(zhì)表達的丙酮酸激酶，對水稻生長發(fā)育和農(nóng)藝性狀的影響是非常顯著的。丙酮酸激酶是糖酵解途徑中的3個關(guān)鍵調(diào)控酶之一，催化糖酵解的最后一步：磷酸烯醇式丙酮酸將磷酸基團轉(zhuǎn)移給 ADP生成ATP，同時生成丙酮酸。植物中的丙酮酸激酶存在胞質(zhì) (Cytosolic) 和質(zhì)體 (Plastid) 的同工酶：PKc和 PKp[8]，并且呈組織特異性表達。在根部，OsPK1的表達主要限定在根尖的成熟區(qū)和根毛區(qū)。這兩個區(qū)域是執(zhí)行吸收功能的主要區(qū)域。本研究利用粳稻品種日本晴野生型 (Wild type，WT) 和突變體ospk1兩個材料，分析OsPK1在突變體中表達顯著下降是否影響水稻幼苗對外源糖分的吸收。目前，丙酮酸激酶對水稻生長發(fā)育的生理作用還知之甚少，因此本研究有助于更好了解丙酮酸激酶OsPK1的功能。

本研究通過改變1/2 MS培養(yǎng)基中蔗糖的含量，分析水稻幼苗，特別是根對外源糖分的吸收和響應(yīng)。發(fā)現(xiàn)含外源糖分的1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的水稻幼苗中的糖含量水平顯著高于那些不含外源糖分的培養(yǎng)基培養(yǎng)的幼苗。同時，外源糖分被水稻幼苗根吸收后能夠促進根的伸長，上調(diào)根中水孔蛋白基因的表達。我們還發(fā)現(xiàn) OsPK1在突變體中表達下調(diào)影響了糖代謝和外源糖分的吸收。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

水稻 Oryza sativa粳稻栽培種日本晴(Nipponbare) 用作野生型植物材料。突變體ospk1的背景是日本晴[7]。生長10 d的野生型和ospk1的幼苗用1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng) (添加或不加蔗糖)，在光照培養(yǎng)箱里培養(yǎng) (14 h 光照，30 ℃；10 h 黑暗，26 ℃)。

1/2 MS培養(yǎng)基所用試劑均采用進口或國產(chǎn)分析純。Taq酶購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 糖含量的測定

測定生長10 d的野生型和突變體幼苗葉片、葉鞘和根中的糖含量。參照以前文獻中描述的方法[9]，葡萄糖、果糖、半乳糖和蔗糖用80%甲醇提取，通過GC-MS的方法進行含量測定。實驗做2次生物學重復。每次重復平行進樣3次進行分析。

1.2.2 半定量RT-PCR

總 RNA用 TRIzol 試劑 (Invitrogen公司)提取。瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計 (ND-1000，NanoDrop公司) 確定 RNA的質(zhì)量與濃度后，DNaseⅠ(Invitrogen公司) 消化 1 h。采用SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System (Invitrogen) 試劑盒，按照操作手冊，以大約5 mg總RNA和Oligo (dT)20引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。每個基因做2次生物學重復，選擇代表性的結(jié)果。1個cDNA模板做3次獨立的PCR。

水稻Actin作為參照基因。對3個水孔蛋白基因和OsPK1進行半定量RT-PCR分析，所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表1。

表1 RT-PCR分析所用引物Table 1 RT-PCR primers used in this study

1.2.3 統(tǒng)計學分析

分析野生型和突變體材料中糖含量數(shù)據(jù)以及MS(+)組和MS(?)組幼苗根系長度是否有顯著性差異，采用t檢驗，如果P＜0.05，則視為顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻根能夠吸收外源糖分

為了闡明水稻根對外源糖分的吸收和利用，分別用加蔗糖和不加蔗糖的1/2 MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)野生型和ospk1水稻幼苗。幼苗長到10 d后，通過GC-MS分析測定其糖含量 (表2)。將常規(guī)的配方中含30 g/L蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基命名為MS(+)，不加蔗糖的為 MS(?)。結(jié)果顯示生長在MS(+)上的野生型幼苗中的蔗糖、葡萄糖、果糖和半乳糖水平明顯高于MS(?)上生長的幼苗。例如 MS(+)上生長的野生型幼苗根中蔗糖含量為(1 691±116) mg/g FW，而MS(?)上生長植株則為(26.8±1.9) mg/g FW。表2結(jié)果指出水稻根能夠吸收和利用外源糖分，使根和地上組織中的糖含量顯著增加。

表2 添加蔗糖培養(yǎng)基MS(+)與不加蔗糖MS(?)培養(yǎng)的野生型和突變體ospk1幼苗中的糖含量*Table 2 Sugar levels in young seedlings of WT and ospk1 grown in MS(+) (medium adding sucrose) and MS(?) (no sucrose added)

2.2 OsPK1表達下調(diào)影響了糖代謝和外源糖分的吸收

MS(?)上生長的野生型日本晴和 ospk1突變體幼苗葉中糖含量存在差異 (表2)。突變體幼苗葉片中葡萄糖含量低于野生型幼苗，而蔗糖含量較高。突變體幼苗葉鞘中葡萄糖、果糖和蔗糖含量均高于野生型幼苗。而根中糖含量沒有差異。我們以前報道了 ospk1突變體中糖酵解/糖異生途徑部分酶的表達發(fā)生改變[7]。推測丙酮酸激酶OsPK1作為糖酵解途徑中的關(guān)鍵調(diào)控酶，其表達下調(diào)影響了糖酵解/糖異生途徑，進而影響糖代謝。ospk1突變體中糖酵解途徑可能受到抑制，導致幼苗葉片中蔗糖的積累，葉鞘中葡萄糖、果糖和蔗糖儲藏量的增加。已指出OsPK1表達下調(diào)也影響了糖的運輸[7]。因此，MS(?)上生長的野生型和 ospk1幼苗根中糖含量沒有差異，可能是由于突變體中糖從葉鞘到根的傳輸受到了抑制。

MS(+)上生長的野生型和 ospk1突變體幼苗中糖含量也存在差異 (表2)。突變體幼苗葉片中葡萄糖、果糖和蔗糖含量均低于野生型幼苗。突變體根中蔗糖含量也明顯低于野生型根。推斷OsPK1表達下調(diào)影響了外源糖分的吸收。

2.3 水稻根對外源糖分的吸收能夠促進根的伸長

生長在 MS(+)上的水稻苗的根系明顯比MS(?)上的根系長 (圖 1A)。根系長度統(tǒng)計結(jié)果顯示，MS(+)組幼苗根系長度大于 MS(?)組，呈顯著性差異 (圖1B)。推斷來自MS(?)的根系中較低的糖水平嚴重抑制了根的伸長。此外，對生長在MS(+)上的水稻苗來說，野生型苗的根系比突變體ospk1的根系略長，與野生型幼苗根中糖水平略高一致。同時，對生長在MS(?)上的水稻苗來說，野生型和突變體根系長度沒有差異，與它們根中糖水平?jīng)]有差異的結(jié)果一致。

圖1 添加蔗糖培養(yǎng)基MS(+)與不加蔗糖MS(?)培養(yǎng)的幼苗根系長度的比較Fig.1 Comparison of root length of young seedlings grown in MS(+) (medium adding sucrose) and MS(?) (no sucrose added). (A) The roots of 10-day-old seedlings. (B) The root length of 10-day-old seedlings. Values shown are ±s (n =20). Asterisks mark the significant differences (P<0.05) between MS(+) and MS(?).

2.4 根對外源糖分的吸收上調(diào)水孔蛋白基因的表達

推測生長在 MS(+)上的水稻苗吸收外源糖分從而導致較高水平的糖含量，會影響其滲透勢，可能導致參與水分運輸?shù)乃椎鞍谆虻谋磉_受到影響。預測在水稻基因組中有 33個水孔蛋白基因，葉片、根和花藥中都有水孔蛋白基因表達，且具有組織和細胞特異性定位[4,10]。OsPIP2;4和OsPIP2;5主要在根中表達，其表達產(chǎn)物水孔蛋白具有高的水通道活性[4,10]。OsTIP2;1也編碼水孔蛋白，在根和花藥中表達[4]。通過半定量RT-PCR檢測了根中這三個水孔蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平 (圖2)。與生長在MS(?)上的根比較，在MS(+)生長的根 (與外源糖分直接接觸)中，OsPIP2;4, OsPIP2;5和OsTIP2;1的表達顯著增加，并且野生型植株根中 OsPIP2;5和OsTIP2;1的表達比突變體要高。而OsPK1的表達在MS(+)組和MS(?)組間的差異不明顯，推斷水稻根中葡萄糖、果糖、半乳糖和蔗糖水平的高低不同基本不影響OsPK1轉(zhuǎn)錄水平的表達。

3 討論

圖2 添加蔗糖培養(yǎng)基MS(+)與不加蔗糖MS(?)培養(yǎng)的幼苗根中水孔蛋白基因和OsPK1的表達Fig.2 Expression of three aquaporin genes and OsPK1 in root of young seedlings grown in MS(+) (medium adding sucrose) and MS(?) (no sucrose added).

外源糖對植物生理生化特性的影響在烤煙、莧菜幼苗、毛白楊組培芽苗氣培生根和白樺葉片已有研究報道[11-15]。此外，外源糖能夠影響蘋果果實山梨醇代謝相關(guān)酶 (山梨醇脫氫酶和山梨醇氧化酶) 的活性[16]。還發(fā)現(xiàn)外源糖能夠調(diào)控水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因Ugp1的表達[17]。本研究主要目的是揭示水稻根對外源糖分吸收在幼苗糖含量和根系發(fā)育兩方面的影響，同時探究 OsPK1表達下調(diào)是否會影響到水稻幼苗對外源糖分的吸收。選用了兩種植物材料：野生型日本晴和ospk1突變體。采用了兩組幼苗進行比較，一組用 MS(+) (添加蔗糖) 培養(yǎng)，一組用MS(?) (不加蔗糖) 培養(yǎng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)紅甜菜毛狀根在液體培養(yǎng)5 d后，培養(yǎng)基中的蔗糖能被胞外蔗糖酶水解，從而葡萄糖和果糖水平增加[1]。本研究MS(+)培養(yǎng)是常規(guī)1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)，最初添加了30 g/L蔗糖，但隨著水稻苗的生長，推斷培養(yǎng)基中部分蔗糖會被水解為葡萄糖和果糖，因此本研究水稻根吸收的是各種糖分，而不僅僅是蔗糖。

相比對照組 MS(?)培養(yǎng)的苗，MS(+)培養(yǎng)的水稻苗的葉片、葉鞘和根均含有更高水平的葡萄糖、果糖、半乳糖和蔗糖，指出外源糖分能被水稻根吸收，且進一步被地上組織利用，產(chǎn)生一個向上的糖物質(zhì)的流動。

相比對照組 MS(?)培養(yǎng)的苗，MS(+)組中野生型日本晴和ospk1突變體兩種材料在根對外源糖分的吸收、根系的伸長以及水孔蛋白基因的表達三方面的表現(xiàn)是基本一致的，但存在程度差異。MS(+)上生長的突變體幼苗葉片中葡萄糖、果糖和蔗糖含量均低于野生型幼苗，根中蔗糖含量也明顯低于野生型根。已報道在擬南芥突變體pkp1種子中質(zhì)體丙酮酸激酶活性降低導致己糖、蔗糖和淀粉量增加[18]。還發(fā)現(xiàn)馬鈴薯球莖轉(zhuǎn)基因系PKC-6中，胞質(zhì)丙酮酸激酶表達降低導致葡萄糖和蔗糖濃度高于野生型[19]。本研究看似相反的結(jié)果，很可能是由于 OsPK1表達下調(diào)影響外源糖分吸收所致。

前面已述及，擬南芥的根感應(yīng)到輕度的滲透脅迫后，會減少對外源蔗糖的吸收，從而對側(cè)根形成產(chǎn)生抑制[2]。有趣的一點是，本研究中水稻根對外源糖分的吸收能夠促進根系的伸長，也沒有發(fā)現(xiàn)側(cè)根形成受到抑制。生長在MS(+)上的水稻苗對外源糖分的吸收從而導致的高水平的糖含量，會影響其滲透勢。因此推測存在一個調(diào)控機制來平衡滲透勢和解除滲透脅迫。三個水孔蛋白基因OsPIP2;4，OsPIP2;5和OsTIP2;1在吸收外源糖分的根中的表達顯著上調(diào)，表明水孔蛋白參與的水分運輸增強以維持水平衡和調(diào)節(jié)滲透勢。

在根部大量水孔蛋白在毗鄰根尖 (離根尖大約1.5~4 mm) 的區(qū)域積累[10]。PIPs和TIPs是水孔蛋白大家族中主要的兩個亞家族，是植物細胞吸收水分的主要通道。它們是否參與外源糖分吸收過程需要進一步研究。

本研究結(jié)果揭示了 4點：1) 培養(yǎng)的水稻苗的根能夠吸收和利用外源糖分；2) OsPK1表達下調(diào)影響了糖代謝和外源糖分的吸收；3) 水稻根對外源糖分的吸收能夠促進根的伸長，這為更好地控制植物根系伸長提供了一個好的線索；4) 水稻根對外源糖分的吸收上調(diào)根部水孔蛋白基因的表達，來增強水分運輸以維持組織水分平衡和調(diào)節(jié)滲透勢。

致謝 感謝北京林業(yè)大學蔣湘寧教授和程小喬在糖含量測定實驗中的幫助。

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