李泰明，谷春嬌，葛曉宇，李哲哲，王丹，馬艷紅，劉濤，張美由，李麗，劉景晶

中國藥科大學天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009

Exendin-4是從希拉毒蜥唾液中分離到的一種含有 39個氨基酸的多肽，與人胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1) 有 53%的同源性[1]。作為 GLP-1受體激動劑，Exendin-4具有促進葡萄糖依賴性的胰島素分泌[2]，刺激胰島 β細胞再生[3]，抑制餐后胰高血糖素的產(chǎn)生、延遲胃排空、抑制食欲等作用[4-5]，并且其半衰期遠遠長于 GLP-1[6]。Exendin-4的這些生理功能使其在 2型糖尿病的治療中顯示了廣闊的前景。

化學合成的Exendin-4的酰胺化修飾類似物已于2005年在美國FDA批準上市 (商品名Byta)[7]，但化學合成的Exendin-4類似物存在成本較高，價格昂貴，步驟多，收率低，過程涉及有害化學物質等缺點[8]?，F(xiàn)有的基因工程方法合成的Exendin-4常出現(xiàn)表達量較低的情況[9-11]，一方面可能是由于天然Exendin-4 C端36-39位氨基酸存在 PPPS的剛性結構，有研究表明[12-13]，Exendin-4 C端的 31-39位氨基酸形成的色氨酸籠子在與GLP-1受體的結合方面作用很小，截去了PPPS對活性影響不大，所以本實驗優(yōu)選了截短型的 Exendin-4[14]，并在截短型的 Exendin-4的N端添加2個脯氨酸與融合伴侶C端的天冬氨酸形成酸水解位點；另一方面是由于小分子多肽在大腸桿菌表達系統(tǒng)中容易降解[15]，本實驗室將Exendin-4類似物與一含有132個氨基酸的融合伴侶通過酸水解位點連接，在大腸桿菌中實現(xiàn)了融合蛋白的高表達，不需要使用較為昂貴的腸激酶等[16-17]，在鹽酸作用下即可將融合伴侶與目的肽分離，根據(jù)目的肽與融合伴侶等電點的差異，通過離子交換層析分離得到Exendin-4類似物，獲得的目的肽中不含有二硫鍵，通過http://mobyle. pasteur.fr/cgi-bin/portal.py網(wǎng)站在線預測其二級結構為線性，與Exendin-4的二級結構相似，包涵體經(jīng)處理后不需要復性等步驟，分離純化方法簡便。健康雄性ICR小鼠口服糖耐量實驗初步驗證Exendin-4類似物的活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

分子克隆工具酶及 T4 DNA 連接酶(Fermentas公司)；質粒抽提試劑盒 (南京天為生物科技有限公司)；PCR膠回收試劑盒 (TaKaRa公司)；分子量截留量2 000 Da的透析袋、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；引物合成 (GeneScript Corporation公司)；DNA測序 (南京金思瑞生物技術有限公司)；Sephadex A-50陰離子交換樹脂 (GE health)；GLP-1標準品為中國藥科大學藥化實驗室贈與；胰島素注射液 (40 U/mL) 購自江蘇萬邦公司；血糖測試儀和血糖試紙 (北京怡成生物電子技術有限公司)；小鼠胰島素測定試劑盒 (瑞典Mercodia公司)；其余試劑均屬國產(chǎn)分析純。

1.1.2 質粒、菌株與動物

重組質粒pED[18]及重組質粒5＃由本實驗室構建保存，菌株E. coli BL21由本實驗室保存。清潔級6~8周齡，雄性ICR小鼠購自揚州大學實驗動物中心［合格證號: SCXK(蘇)2007-0001］。

1.2 方法

1.2.1 Exendin-4類似物基因的克隆

構建過程見圖1，構建所需引物見表1。PCR反應以pED質粒中的Pro-Pro-Exendin-4-Asp基因為模板，M1及M2分別為上下游引物，反應參數(shù)為：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 1 min，56 ℃，40 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收。

1.2.2 融合伴侶基因的改造

根 據(jù) 鉸 鏈 區(qū) (-CPPCPAP-) 和 八 肽(-KRKRKKSR-) 的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子轉化成核苷酸序列，插入 pED載體融合伴侶C-端的蘇氨酸的核苷酸序列之后，并在融合伴侶 5￠端增設 NcoⅠ酶切位點，3￠端增設BamHⅠ酶切位點，在計算機輔助分析后，PCR反應以pED質粒中融合伴侶基因為模板，P1及P2分別為上下游引物，反應參數(shù)為：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 0.5 min，55 ℃ 0.5 min ，72 ℃ 1 min，28個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收純化。

PCR產(chǎn)物經(jīng)NcoⅠ、BamHⅠ37℃雙酶切2 h，純化酶切產(chǎn)物Ⅰ。pED質粒經(jīng)NcoⅠ、BamHⅠ于37 ℃雙酶切2 h，純化酶切產(chǎn)物Ⅱ。T4 DNA連接酶16 ℃連接酶切產(chǎn)物Ⅰ、Ⅱ。將連接產(chǎn)物轉化E. coli BL21感受態(tài)細胞后涂布于含100 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆進行菌落 PCR鑒定后測序，將測序正確的重組的pED質粒命名為5＃質粒。

1.2.3 Exendin-4類似物基因表達載體的構建

圖1 5#重組質粒構建過程示意圖Fig. 1 Construction of 5# recombinant plasmid.

表1 引物DNA序列Table 1 DNA sequence of primers

Exendin-4類似物基因的 PCR 產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ、Hind Ⅲ 37 ℃雙酶切2 h，純化酶切產(chǎn)物Ⅰ。5＃質粒經(jīng) BamHⅠ，Hind Ⅲ 37 ℃雙酶切2 h，純化酶切產(chǎn)物Ⅱ。T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接酶切產(chǎn)物Ⅰ、Ⅱ。將連接產(chǎn)物轉化E. coli BL21感受態(tài)細胞后涂布于含100 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆進行菌落PCR鑒定后測序。

1.2.4 融合蛋白的誘導表達及分離純化

測序正確后，在搖瓶實驗的基礎上采用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件，以 1%接種量在 LB培養(yǎng)基中37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)8~10 h后，5%的接種量轉接于6.5 L玉米漿發(fā)酵液中，添加1%色拉油作為消泡劑，攪拌轉數(shù)為560 r/min，上罐后3.5 h后OD600達到1.4，加入終濃度為5 mmol/L的乳糖誘導，8 h后收集發(fā)酵液，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集菌體，SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達情況。

分離純化過程與文獻[19]相似。將收集到的菌體按 4 mL/g 的體積加入菌體裂解緩沖液(0.02%溶菌酶，0.75% TritonX-100，50 mmol/L Tris-HCL，1 mmol/L EDTA) 37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)，裂解至溶液不粘滯時，4 ℃、12 000 r/min離心20 min收集沉淀。每克裂解后的菌體沉淀加入10 mL包涵體洗滌液1 (0.2% TritonX-100，50 mmol/L Tris-HCl)，將包涵體懸浮于洗滌液1中劇烈振蕩2 h后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min收集沉淀。將沉淀加入適量蒸餾水中重懸洗滌，洗滌后4 ℃、12 000 r/min離心20 min收集沉淀。得到的包涵體在包涵體洗滌液2 (2 mol/L尿素，10% TritonX-100) 中洗滌2次，4 ℃、12 000 r/min離心20 min收集洗滌后的包涵體。每克包涵體加入8 mL包涵體溶解液 (8 mol/L尿素, 50 μmol/L Tris-HCl)，混勻，4 ℃攪拌過夜，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液。將得到的上清進行乙醇分級沉淀，首先加入0.5倍體積的?20 ℃預冷的無水乙醇，邊加邊輕輕攪拌以沉淀雜蛋白，?20 ℃放置20 min，12 000 r/min離心20 min，收集上清。在離心后上清中加入1倍體積的預冷的無水乙醇沉淀融合蛋白，?20 ℃放置20 min，12 000 r/min離心20 min，收集上清。向離心后上清中加入3倍體積的預冷的無水乙醇沉淀融合蛋白，?20 ℃放置2 h，12 000 r/min離心20 min后收集沉淀，得到融合蛋白。

1.2.5 融合蛋白的酸水解

融合蛋白中加入50 mmol/L鹽酸溶液 (融合蛋白含量為5%)，置于48 ℃水浴鍋水解48 h，將酸水解后的溶液pH分別調至7.6、9.3，進行等電點沉淀，4 ℃放置2 h后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min離心，去除沉淀中的雜蛋白，得到目的肽含量豐富的上清。

1.2.6 Exendin-4類似物的分離純化

將等電點沉淀離心后的上清液在0.02 mol/L乙酸銨 (pH 5.6) 中透析48 h，上樣于0.02 mol/L乙酸銨(pH 5.6) 平衡好的QAE Sephadex A-50離子交換柱，使用含0.05、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl的乙酸銨 (pH 5.6) 溶液進行階段洗脫，280 nm波長處檢測吸收。收集樣品，Tris-Tricine-PAGE電泳分析蛋白純度，透析除鹽并凍干。送至中國藥科大學分析測試中心進行電噴霧質譜(ESI-MS) 測定Exendin-4類似物相對分子質量。

1.2.7 Exendin-4 類似物的體內生物活性測定

清潔級6~8周齡的健康雄性ICR小鼠，每籠7只，自由飲水攝食，適應環(huán)境1周后隨機分8組，分別為空白對照組，胰島素組，GLP-1低劑量給藥組，GLP-1中劑量給藥組，GLP-1高劑量給藥組，Exendin-4低劑量給藥組，Exendin-4中劑量給藥組，Exendin-4高劑量給藥組，每組 7只，稱重并編號，實驗前禁食12 h，僅給予飲水。胰島素組皮下注射給予20 μg/kg胰島素，GLP-1低、中、高劑量給藥組及Exendin-4類似物低、中、高劑量給藥組分別皮下注射給予20 μg/kg、80 μg/kg、140 μg/kg樣品 (上述樣品均溶于pH 7.0的滅菌磷酸鹽緩沖液后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌)；空白對照組小鼠皮下給予等量磷酸鹽緩沖液。各組小鼠分別于給藥后 15 min，灌胃2.0 g/kg葡萄糖，并于葡萄糖負荷后0、10、20、40、60、80、100、120 min對小鼠進行尾靜脈取血，血糖儀測定血糖。給予葡萄糖10~20 min后斷尾取血100 μL于含20 μL、0.1 mol/L EDTA的滅菌EP管中，4 ℃、13 000 r/min離心30 s，取上清，小鼠胰島素含量測定試劑盒檢測小鼠血漿中胰島素含量，所有實驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗進行組間比較。

2 結果

2.1 Exendin-4類似物基因表達載體的構建

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳后在約131 bp處有明亮條帶，與已知Exendin-4類似物基因大小 (131 bp)相吻合，見圖2。成功將pED質粒的融合伴侶改造為 5＃質粒具有的融合伴侶，以重組 5＃質粒為模板，M3、M2分別為上下游引物進行融合蛋白基因的PCR擴增，PCR產(chǎn)物在約531 bp出現(xiàn)條帶 (圖3)，與預期結果相符。測序結果表明，Exendin-4類似物基因成功插入 5＃載體的BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點之間，序列比對后與預期結果完全一致。

2.2 融合蛋白的表達及 Exendin-4類似物的純化

圖2 Exendin-4類似物基因的PCR擴增結果Fig. 2 Application results of Exendin-4 analogue gene by PCR. 1: DNA molecular marker; 2: product of PCR.

圖3 重組質粒的PCR驗證Fig. 3 PCR identification of recombinant plasmid. 1: DNA molecular marker; 2: product of recombinant plasmid.

乳糖誘導表達的融合蛋白經(jīng) SDS-PAGE電泳分析，融合蛋白以包涵體形式存在。與未經(jīng)乳糖誘導組相比，在相對分子量約22.11 kDa處可見融合蛋白的表達條帶，大小與預期相符，經(jīng)過BandScan軟件分析，表達量約占菌體總蛋白的40% (圖4)。離子交換層析分離Exendin-4類似物過程中，0.3 mol/L NaCl洗脫時可以收集到樣品峰，經(jīng) Tris-Tricine-PAGE電泳后，BandScan軟件分析目的肽的純度為91.8% (圖5)，透析并凍干，于?20℃保存。電噴霧質譜給出的一組峰分子量都相差22，是加了不同個數(shù)的鈉離子峰。如：m/z 4139 是[M+Na]+，m/z 4161 是[M+2Na-H]+，m/z 4183是[M+3Na-2H]+等等，由此分析出目的肽相對分子質量為4 116.4 Da，與理論推算值4 115.95 Da基本一致 (圖6)。

2.3 Exendin-4類似物的降血糖活性檢測

結果見表 2。Exendin-4各組給藥后，給予2.0 g/kg葡萄糖，在葡萄糖負荷后，Exendin-4各劑量組隨著劑量的增加，存在劑量依賴關系。Exendin-4各劑量組與空白對照組相比能夠顯著降低血糖濃度 (P<0.01)，與 GLP-1各劑量組相比降糖作用較為顯著 (P<0.01)，與胰島素組相比并未引起低血糖效應。

圖4 SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白表達情況Fig. 4 SDS-PAGE analysis of fusion protein. M: protein molecular marker; 1: non-inducing expression of fusion protein; 2: lactose-induced expression of fusion protein.

圖5 Tris-Tricine-PAGE電泳檢測Exendin-4類似物純度Fig. 5 The purity analysis of Exendin-4 analogue by Tris-Tricine-PAGE. 1: Exendin-4 analogue; 2: insulin.

圖6 Exendin-4類似物的電噴霧質譜分析Fig. 6 ESI-MS analysis of Exendin-4 analogue.

表2 Exendin-4類似物的降血糖活性 (與空白對照組比較*P<0.05,**P<0.01；與 GLP-1組比較#P<0.05, ##P<0.01)Table 2 The activity of Exendin-4 analogue in decrease hypoglycaemia (Compare with control *P<0.05, **P<0.01; compare with GLP-1 #P<0.05, ##P<0.01)

2.4 Exendin-4類似物的促進胰島素分泌活性檢測

從圖 7可以看出，Exendin-4各給藥組小鼠在葡萄糖負荷后，其血清胰島素水平均有升高趨勢，并呈劑量依賴性，與空白組相比，Exendin-4類似物的低、中、高劑量均能顯著升高血漿胰島素濃度 (P<0.01)；Exendin-4類似物的低、中、高劑量組與 GLP-1各劑量組相比亦能顯著性地升高血漿胰島素濃度(P<0.01)。

圖7 Exendin-4類似物對血液胰島素濃度影響 (與空白對照組比較*P<0.05, **P<0.01；與GLP-1組比較#P<0.05, ##P<0.01)Fig. 7 The activity of Exendin-4 analogue in plasma insulin. Compare with control *P<0.05, **P<0.01; compare with GLP-1 #P<0.05, ##P<0.01.

3 討論

目前通過基因工程方法獲得Exendin-4及其類似物的表達系統(tǒng)共有兩類：一類是真核表達系統(tǒng)，如張紅緒等[20]報道了Exendin-4基因在巴斯德畢赤酵母中的分泌表達，表達量較低；王暉等[21]同樣在巴斯德畢赤酵母中實現(xiàn)了 Exendin-4類似物基因串聯(lián)體的分泌表達，表達量較高，但出現(xiàn)了前導序列切割不完全的情況，由于是以腸激酶識別序列連接Exendin-4類似物的串聯(lián)體，重組蛋白在純化過程中產(chǎn)生嚴重降解，即使經(jīng)離子交換和親和層析，仍不能去除可能存在的蛋白酶，抑制目的蛋白的降解。另一類是大腸桿菌表達系統(tǒng)，有文獻[22]在大腸桿菌中成功分泌表達Exendin-4，表達量較低，為了便于后續(xù)分離純化，其將組氨酸標簽與目的肽相連而無法除去，這在一定程度上影響了Exendin-4的活性；本研究中所采用的是大腸桿菌表達系統(tǒng)，融合蛋白以包涵體的形式表達，避免了分泌表達造成的信號肽切割不完全，表達量較低，目的蛋白以腸激酶切割容易降解等缺點，融合蛋白酸水解后在Exendin-4類似物N端殘留的脯氨酸在進入體內后，被體內的二肽基肽酶 (DPPIV) 水解，不會影響活性；此外，Exendin-4類似物為線性肽，不需要復性等繁瑣步驟。

前人曾利用 pED載體表達 Exendin-4類似物，表達量不高，形成的包涵體結構松散，融合伴侶與目的肽等電點相近，酸水解過程中產(chǎn)生與目的肽分子量相近的雜多肽無法利用等電點沉淀除去，利用分子篩層析無法將目的肽有效分離。本研究 pED載體融合伴侶基因區(qū)域增添了CPPCPA肽段及KRKRKKSR肽段的基因，從而成為5＃載體。CPPCPAP肽段富含的半胱氨酸使融合蛋白之間以相互交織的二硫鍵相連，所形成的包涵體結構致密；KRKRKKSR肽段富含的堿性氨基酸使融合伴侶的等電點由5.15升為9.30，與Exendin-4類似物的等電點4.59差距較大，便于等電點沉淀除去雜蛋白及離子交換層析分離純化目的肽。

由實驗結果可以初步判定此種Exendin-4類似物具有促進胰島素的分泌及調節(jié)血糖作用，并且這種作用是葡萄糖濃度依賴性的。本課題組計劃在后續(xù)的研究中建立2型糖尿病動物模型，長效實驗進一步驗證其是否具有促進胰島β細胞增殖及降低糖化血紅蛋白 (HbA1c) 水平的作用及其體內藥代動力學各相關指標。

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