唐雙焱，梁朝寧，蔣培霞

中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

定向進(jìn)化是近年發(fā)展起來的十分高效的蛋白質(zhì)改造手段[1]。定向進(jìn)化方法的內(nèi)容包括從一個或者多個親本酶出發(fā)，經(jīng)過基因突變和重組人工構(gòu)建蛋白質(zhì)突變體文庫，然后通過合適的篩選方法快速從突變體文庫中篩選出符合要求的突變體[2]。鑒于突變的隨機(jī)性，定向進(jìn)化法尤其適用于對僅掌握有限的結(jié)構(gòu)和功能信息的蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，以獲得某方面特性顯著提高的突變體。即使在已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)改造上，以定向進(jìn)化法改造所得到的結(jié)果在很多情況下也是人們根據(jù)已有的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的知識所無法預(yù)知的。定向進(jìn)化法彌補(bǔ)了傳統(tǒng)理性設(shè)計(jì)方法的不足，極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研究與應(yīng)用范圍。在定向進(jìn)化策略中，突變體文庫的多樣性和高通量篩選方法的建立是成功的關(guān)鍵。突變體文庫越大，突變體數(shù)量越多，則越有希望篩選到所需要的突變體。對于這些龐大的突變體文庫，高通量的篩選是必需的。目前，構(gòu)建數(shù)量龐大的突變體文庫的方法已日趨成熟，而最大瓶頸是缺乏高通量的篩選方法。很多蛋白質(zhì)目前還無法用定向進(jìn)化方法進(jìn)行改造就是因?yàn)槿狈Ω咄康暮Y選方法。本文將對現(xiàn)階段一些已經(jīng)應(yīng)用或有潛力應(yīng)用于定向進(jìn)化中的高通量篩選方法進(jìn)行綜述。本文將側(cè)重于介紹小分子化合物的特異性識別和高通量篩選方法，這些方法通?？捎糜诟脑旌铣蛇@些小分子化合物的酶 (酶對底物的特異性和專一性使之成為最適合合成精細(xì)化學(xué)分子、手性分子等的催化劑)，或者結(jié)合這些小分子化合物的蛋白質(zhì)如提高抗原抗體親和力等。

1 體內(nèi)篩選方法

體內(nèi)篩選方法指根據(jù)蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞表型之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系來進(jìn)行篩選。體內(nèi)篩選方法具有成本低、快捷等優(yōu)勢，但篩選結(jié)果也受到諸多因素的影響，如細(xì)胞生長情況、蛋白表達(dá)量及折疊情況、底物通透性等。

1.1 營養(yǎng)缺陷型菌株篩選法

營養(yǎng)缺陷型菌株是通過誘變處理獲得的，在營養(yǎng)上表現(xiàn)缺陷的菌株，即喪失合成某一物質(zhì)(如氨基酸、維生素、核苷酸等) 的能力，因而它們在基本培養(yǎng)基上不能生長，必須補(bǔ)充某些物質(zhì)才能正常生長。營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選一般要經(jīng)過誘變、抗生素淘汰野生型、缺陷型菌株的檢出和鑒定等步驟來獲得。由于營養(yǎng)缺陷型菌株只有在添加了特別成分的培養(yǎng)基中才能生長，因此可以用來對合成這種成分的酶或者合成途徑進(jìn)行高通量篩選。營養(yǎng)缺陷型菌株已經(jīng)成功運(yùn)用在多例酶的定向進(jìn)化篩選中[3-9]。如Pfleger等在對合成甲羥戊酸的操縱子上3個酶的相對表達(dá)量進(jìn)行改造以提升甲羥戊酸產(chǎn)量的研究中，即用到了營養(yǎng)缺陷型篩選方法[7]。該研究中構(gòu)建的篩選細(xì)胞(大腸桿菌) 依賴甲羥戊酸生長，并同時表達(dá)熒光蛋白基因，當(dāng)甲羥戊酸被合成時，細(xì)胞方可在基本培養(yǎng)基上生長，且合成甲羥戊酸的濃度可通過細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來體現(xiàn)。用該營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞篩選甲羥戊酸操縱子突變體文庫，成功獲得了高產(chǎn)突變體。Boersma等采用天冬氨酸營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞篩選法改造來自芽胞桿菌的脂肪酶A[8]。在基本培養(yǎng)基中加入天冬氨酸(S)-(+)-1,2-O-異亞丙基甘油醚作為底物，當(dāng)?shù)孜锉恢久窤水解產(chǎn)生天冬氨酸時，細(xì)胞方能在培養(yǎng)基中生長。通過該方法可篩選到催化活性提高的脂肪酶A。為了篩選到立體選擇性也同步提高的酶突變體，同時在上述培養(yǎng)基中加入了與底物立體結(jié)構(gòu)相反的酶抑制劑膦酸(R)-(-)-1,2-O-異亞丙基甘油醚，并在逐輪的篩選中提高該抑制劑的濃度，最后篩到的酶突變體對(S)-(+)-底物的立體選擇性顯著提高。Kagamiyama等在用定向進(jìn)化方法改造谷草轉(zhuǎn)氨酶以增強(qiáng)其合成支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸的催化效率中，成功運(yùn)用支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的缺陷型細(xì)胞作為篩選工具[9]。谷草轉(zhuǎn)氨酶催化天冬氨酸的氨基轉(zhuǎn)移到 α-酮戊二酸形成草酰乙酸和谷氨酸及其逆反應(yīng)。支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶則催化支鏈氨基酸生物合成最后一步反應(yīng)，在該酶缺乏的情況下，缺陷型細(xì)胞不能在不加支鏈氨基酸的基本培養(yǎng)基上生長。經(jīng)過篩選，谷草轉(zhuǎn)氨酶合成纈氨酸和異亮氨酸的效率分別提高了105和7×104倍，而對其天然底物的催化效率下降20倍。

1.2 酵母雙雜交或三雜交篩選法

酵母雙雜交法利用酵母的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制來進(jìn)行篩選[10-13]。如酵母GAL4轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白具有兩個功能域：DNA結(jié)合功能域和激活功能域。將兩個功能域的編碼基因分別接上不同的蛋白質(zhì)編碼序列，一個是已知蛋白質(zhì)序列，另一個是未知的、將進(jìn)行篩選的蛋白質(zhì)序列 (突變體文庫)，構(gòu)建成融合表達(dá)載體。當(dāng)兩個蛋白質(zhì)能相互作用時，GAL4的DNA結(jié)合功能域和激活功能域也相互靠近，重組成有活性的轉(zhuǎn)錄激活子，開啟受其調(diào)控的啟動子表達(dá)下游的報(bào)告基因，因此通過報(bào)告基因的表達(dá)可篩選出能和已知蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。酵母雙雜交體系常被用于抗體抗原相互作用等多種突變體文庫的篩選當(dāng)中[12-13]。

當(dāng)兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用是由小分子化合物所介導(dǎo)時，酵母雙雜交體系被拓展為酵母三雜交體系，該體系可用于篩選蛋白質(zhì)與小分子化合物之間的相互作用[14-18]。如 Zhao研究組在改造人的雌激素受體蛋白的配體結(jié)合特異性時采用了酵母三雜交方法進(jìn)行篩選。雌激素受體蛋白的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (與GAL4 DNA結(jié)合功能域形成融合蛋白) 與小分子化合物結(jié)合后會發(fā)生構(gòu)象改變，進(jìn)而與核受體共激活因子 (與GAL4激活功能域形成融合蛋白) 相互作用，從空間上拉近 GAL4兩個功能域進(jìn)而開啟調(diào)控的啟動子表達(dá)報(bào)告基因。用該方法篩選獲得了分別與藥物類似物4,4￠-二羥基二苯基乙二酮[16]、睪丸酮[17]或皮質(zhì)酮[18]結(jié)合能力顯著提高的雌激素受體蛋白突變體。

酵母三雜交體系還被進(jìn)一步用來設(shè)計(jì)小分子化合物的水解酶活性的高通量篩選方法。如頭孢菌素酶可水解頭孢菌素，用化學(xué)方法將頭孢菌素同時與氨甲葉酸和地塞米松相連，氨甲葉酸可與二氫葉酸還原酶 (與DNA結(jié)合蛋白LexA融合) 結(jié)合，地塞米松可與糖皮質(zhì)激素受體 (與 B42激活功能域融合) 結(jié)合，因此氨甲葉酸-頭孢菌素-地塞米松形成化合物橋?qū)?DNA結(jié)合蛋白LexA和激活功能域拉近，激活酵母GAL1啟動子表達(dá)下游報(bào)告基因。當(dāng)頭孢菌素酶將頭孢菌素水解時，化合物橋被破壞，從而關(guān)閉了報(bào)告基因的表達(dá)，通過該系統(tǒng)可以成功篩選出頭孢菌素酶的活性，亦為篩選其他化合物水解酶或合成酶提供了模式篩選系統(tǒng)[15]。

1.3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子篩選法

調(diào)控蛋白是結(jié)合特定的DNA調(diào)控序列，通過控制基因開啟和關(guān)閉來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白。調(diào)控蛋白通常與特定小分子化合物結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象變化，從而改變其與相應(yīng)DNA調(diào)控序列的親和力，激活或者阻遏該啟動子下游基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)酶催化生成的小分子化合物可以誘導(dǎo)特定調(diào)控蛋白使之啟動下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)時，該調(diào)控蛋白可以用作該小分子化合物的信號分子，將該化合物在細(xì)胞內(nèi)的濃度與報(bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度關(guān)聯(lián)起來。在對這些小分子化合物的合成酶進(jìn)行定向進(jìn)化改造時，這些信號分子將有潛力作為高通量篩選工具，提高化合物的生物合成效率。

然而，自然界缺乏能分別對各種不同小分子化合物產(chǎn)生誘導(dǎo)反應(yīng)的調(diào)控蛋白。因此人們通過對調(diào)控蛋白進(jìn)行改造，使之改變原有的配體結(jié)合特異性，轉(zhuǎn)而受特定的化合物誘導(dǎo)而啟動下游報(bào)告基因表達(dá)，即定制特定小分子化合物的信號分子[19-21]。通過改造調(diào)控蛋白來定制的不同化合物的信號分子將可以用作高通量篩選工具來篩選這些化合物的生物合成途徑突變體以提升其生物合成效率[22]。目前已有多例調(diào)控蛋白配體結(jié)合特異性成功改造的報(bào)道，如受3-羰基己?；呓z氨酸內(nèi)酯所誘導(dǎo)的 LuxR調(diào)控蛋白被改造成為受不同長度碳鏈的直鏈?；呓z氨酸內(nèi)酯所誘導(dǎo)[23]，受四環(huán)素誘導(dǎo)的調(diào)控蛋白TetR被改造為受四環(huán)素類似物 4-去二甲氨基-6-脫氧-6-去甲基四環(huán)素所誘導(dǎo)[24]。這些研究證明通過改造調(diào)控蛋白定制小分子化合物信號分子這種高通量篩選工具是有效可行的。

1.4 Riboswitch篩選法

細(xì)胞中另外一種能將小分子化合物濃度和基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控關(guān)聯(lián)在一起的分子是Riboswitch[25]。Riboswitch是結(jié)合小分子，參與調(diào)控基因表達(dá)及細(xì)胞代謝的RNA分子，它們廣泛分布于細(xì)菌中，在真菌和植物中也存在。Riboswitch通常位于mRNA的5￠非翻譯區(qū)，也有位于3￠非翻譯區(qū)或內(nèi)含子區(qū)域的。其結(jié)構(gòu)包括適配子和表達(dá)模塊。當(dāng)Riboswitch和小分子化合物結(jié)合后，RNA構(gòu)象發(fā)生變化，在轉(zhuǎn)錄、翻譯或者 mRNA水平上開啟或者關(guān)閉蛋白質(zhì)的合成[25-27]。與改造調(diào)控蛋白的思路相似，人們也試圖通過改造使Riboswitch與特定的小分子化合物結(jié)合而調(diào)控基因表達(dá)，從而設(shè)計(jì)小分子化合物的信號分子。如人們用定向進(jìn)化改造的方法成功獲取了結(jié)合 1,3-二甲基黃嘌呤、3-甲基黃嘌呤或硫胺后能高強(qiáng)度激活下游基因表達(dá)的Riboswitch[28-29]。這些Riboswitch可將相應(yīng)小分子化合物在細(xì)胞內(nèi)的濃度用報(bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度呈現(xiàn)出來，因此也是潛在的高通量篩選工具。

1.5 細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記篩選法

熒光標(biāo)記是首選的高通量篩選標(biāo)記，因?yàn)樗梢杂昧魇郊?xì)胞分選儀進(jìn)行篩選。流式細(xì)胞分選儀的分選速度可達(dá)25 000個細(xì)胞/s以上，這使之成為設(shè)計(jì)高通量篩選方法的首選。用熒光標(biāo)記底物、產(chǎn)物或者酶的篩選方法用于定向進(jìn)化研究也日趨增多。

由于缺乏高通量的篩選方法，糖基轉(zhuǎn)移酶的定向進(jìn)化改造一直受到限制。在唾液酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移活性的定向進(jìn)化改造中，Aharoni等首先設(shè)計(jì)了連有熒光基團(tuán)的受體底物，該底物能自由出入大腸桿菌細(xì)胞，但當(dāng)細(xì)胞中重組唾液酸轉(zhuǎn)移酶將唾液酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到該受體底物上后，糖基化熒光產(chǎn)物由于其分子大小及電荷原因不能透過細(xì)胞膜而滯留在細(xì)胞內(nèi)，因此可以用流式細(xì)胞分選法來篩選轉(zhuǎn)移活性提高了的唾液酸轉(zhuǎn)移酶突變體[30]。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移近年來也被用在小分子化合物的檢測中[31-32]，該方法既可應(yīng)用于體內(nèi)篩選，也可應(yīng)用于體外篩選。兩個熒光基團(tuán)，一個基團(tuán) (供體) 的發(fā)射光譜和另一個基團(tuán) (受體)的激發(fā)光譜有重疊部分，當(dāng)它們的空間距離縮小(＜10 nm) 時，供體基團(tuán)激發(fā)的能量被受體基團(tuán)吸收，使得供體的熒光強(qiáng)度減小而受體的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。Fehr等將大腸桿菌的麥芽糖結(jié)合蛋白的N端與 C端分別與橙色熒光蛋白 (供體熒光基團(tuán)) 和黃色熒光蛋白 (受體熒光基團(tuán)) 融合，當(dāng)該融合蛋白結(jié)合麥芽糖時，構(gòu)象變化使得兩個熒光基團(tuán)靠近，從而發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移，該融合蛋白被成功用作麥芽糖的信號分子測定麥芽糖的濃度[33]。人們還根據(jù)類似原理設(shè)計(jì)了分別結(jié)合葡萄糖[34]、核糖[35]、蔗糖[36]等的信號分子。這些信號分子均有潛力用于高通量篩選這些小分子糖；且該原理亦有潛力應(yīng)用于設(shè)計(jì)不同小分子化合物的信號分子。

2 體外篩選方法

盡管體內(nèi)高通量篩選方法應(yīng)用廣泛，它們?nèi)匀皇艿郊?xì)胞生長壓力以及底物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等問題的限制。體外高通量篩選方法則可克服這些方面的限制因素，與體內(nèi)篩選方法相互補(bǔ)充。體外通量比較高的篩選方法是各種展示技術(shù)，即運(yùn)用DNA重組技術(shù)在噬菌體、細(xì)菌、真菌等表面展示外源蛋白 (突變體文庫)，篩選蛋白與蛋白或者蛋白與小分子之間相互作用。

2.1 噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)比較成熟，首先將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使之與外殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的蛋白保持天然的折疊結(jié)構(gòu)，可以被靶分子識別并結(jié)合，或者催化底物生成產(chǎn)物。該方法的一大應(yīng)用是篩選抗體突變體文庫以獲得與抗原結(jié)合特異性更高的抗體突變體。首先將抗體突變體文庫展示在噬菌體表面上，將抗原固定在酶標(biāo)板等固相介質(zhì)上，加入攜帶了抗體突變體的噬菌體進(jìn)行結(jié)合，然后通過淘洗去除結(jié)合特異性差的抗體，最終得到高結(jié)合特異性抗體[37-38]。該方法也被應(yīng)用在酶的定向進(jìn)化改造中，如Love等用噬菌體展示的篩選方式對大腸桿菌糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了定向進(jìn)化改造。將糖基轉(zhuǎn)移酶的供體底物和受體底物分別用同位素和生物素進(jìn)行標(biāo)記，反應(yīng)產(chǎn)物用捕捉生物素的膜將標(biāo)記的受體捕捉到膜上，洗膜后進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)，放射性強(qiáng)則代表供體底物已被糖基轉(zhuǎn)移酶有效地轉(zhuǎn)移到了受體底物上[39]。

2.2 細(xì)胞表面展示技術(shù)

細(xì)胞表面展示技術(shù)是通過將靶蛋白 (外源蛋白) 基因序列與特定的載體蛋白基因序列融合后導(dǎo)入細(xì)胞，從而使靶蛋白表達(dá)并定位在細(xì)胞表面的技術(shù)。常見的載體蛋白有細(xì)菌外膜蛋白、胞外附屬結(jié)構(gòu) (如鞭毛) 蛋白等，常用的宿主細(xì)胞有大腸桿菌和酵母細(xì)胞等。細(xì)胞表面展示技術(shù)也常被用來篩選蛋白與蛋白間的相互作用，特別是抗原抗體間相互作用。盡管由于細(xì)胞膜脆性等問題，細(xì)胞展示沒有噬菌體展示方法應(yīng)用廣泛，但其優(yōu)勢是細(xì)菌等細(xì)胞大小使其可以采用熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞分選法來進(jìn)行篩選。本篩選方法已被成功應(yīng)用于篩選與抗原高特異性結(jié)合的抗體突變體[40]以及酶催化活性的定向進(jìn)化改造當(dāng)中[41]。

2.3 核糖體展示技術(shù)

核糖體展示技術(shù)也是一種篩選功能性蛋白間相互作用的新技術(shù)，正確折疊的蛋白質(zhì)及其mRNA同時結(jié)合在核糖體上，形成mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三聚體，該結(jié)構(gòu)使目的蛋白的基因型和表型聯(lián)系起來，當(dāng)目的蛋白能與靶分子高特異性結(jié)合時，可以快速獲得其基因型。該技術(shù)雖然尚未得到廣泛應(yīng)用，但也已有一些成功的應(yīng)用案例[42-44]。

本文著重介紹了用于小分子化合物特異性識別和高通量篩選的方法。小分子化合物產(chǎn)品遍及食品、醫(yī)藥、化工等諸多領(lǐng)域，其高通量篩選方法的建立對催化合成小分子化合物的酶的改造研究以及小分子化合物的生物合成途徑研究都具有重要的意義。同時，高通量篩選方法的研究也是定向進(jìn)化方法學(xué)研究的重要組成部分，因此設(shè)計(jì)和開發(fā)新的高通量篩選方法兼具理論和應(yīng)用價值。

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