陳紅艷，劉連成，董娟娥，夏廣東

1 西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌 712100

2 西安陸軍學院，陜西 西安 710108

藥材丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge) 的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩等功效[1]。丹酚酸B (Sal B) 是丹參中的一種酚酸類物質，以Sal B為代表的酚酸類成分被認為是丹參中發(fā)揮藥效的活性物質[2]。Sal B的生物合成是植物體細胞內(nèi)一系列相關信號、酶及基因調(diào)控的復雜的生理過程，其合成積累具有可調(diào)控性。目前普遍認為，丹參酚酸類次生代謝物主要合成于兩條代謝途徑——苯丙烷代謝途徑和迷迭香酸代謝途徑。苯丙氨酸解氨酶 (PAL) 是苯丙烷途徑的第一關鍵酶[3]。在各種生物逆境脅迫下，植物細胞的特征反應之一是苯丙烷代謝途徑的激活[4]。L-苯丙氨酸被 PAL催化合成肉桂酸，再由肉桂酸-4-羥化酶 (Cinnamate-4-hydroxylase，CHA) 催化形成4-香豆酸，再轉化成咖啡酸；L-酪氨酸被酪氨酸氨基轉移酶 (TAT) 催化生成3,4-二羥基苯丙氨酸，由羥苯基丙酮酸還原酶 (Hydroxyphenylpyruvate reductase，HPPR) 催化生成3,4-二羥基苯乳酸，3,4-二羥基苯乳酸和咖啡酸在迷迭香酸合成酶(Rosmarinic acid synthase，RAS) 催化下合成迷迭香酸，再進一步合成Sal B。

水楊酸 (Salicylic acid，SA) 是一種存在于植物體內(nèi)的酚酸類物質，被認為是一種內(nèi)源信號調(diào)控細胞內(nèi)氧化物水平從而抵御外界脅迫[5]。當病原體侵害植物時，SA可以快速積累到較高水平，且與 CAT結合并抑制其活性，從而導致細胞內(nèi)H2O2含量迅速升高。H2O2可以作為信號分子誘導病原相關性蛋白表達以及激活系統(tǒng)獲得性抗性活化[6]。已有研究表明，SA在激活植物對抗各種外界脅迫的抗性方面具有重要作用，如外源施加SA可以有效提高芥菜的耐高溫性[7]，增加黃瓜的耐寒性[8]、抗鹽性[9]及抗重金屬脅迫能力[10]等。SA還可作為誘導子被廣泛用于促進植物次生代謝物的合成[11-12]。

H2O2為活性氧的一種，具有較高的化學反應活性，長期以來被認為是植物代謝中產(chǎn)生的一種毒副產(chǎn)品[13]。現(xiàn)在研究表明，由于H2O2相對穩(wěn)定、可以跨膜運輸，且較其他活性氧分子半衰期長，在配體與受體的相互作用，酶的激活、基因表達、細胞凋亡等過程中均發(fā)揮著作用。因此，H2O2被認為是在活性氧中最適合作信號分子的一種物質，在植物受到各種刺激后介導多種代謝反應[13]。植物體內(nèi)H2O2有多種來源，一方面來自于光合作用和呼吸作用中的電子傳遞過程；另一方面來源于酶途徑，包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADPH) 氧化酶、細胞壁過氧化物酶、胺氧化酶等[13]。H2O2介導多種生理生化過程，如系統(tǒng)獲得性抗性 (Systemic acquired resistance，SAR)、過敏反應 (Hypersensitive resistance，HR)[14-15]、細胞衰老[16]、細胞程序化死亡(Programmed cell death, PCD)[17]等，是植物對細胞內(nèi)信號及外界刺激反應的重要調(diào)節(jié)物，并可介導ABA信號來調(diào)節(jié)氣孔開閉[18-19]、黃瓜不定根的形成和發(fā)育[20]、介導金絲桃次生代謝產(chǎn)物合成的過程[21]。

有關SA與H2O2之間的研究主要集中在SA作為防御反應過程中的信號物質與 H2O2之間的相互關系，如在防御反應中SA參與的信號轉導途徑與升高的H2O2含量水平有關[6]、SA作為上游調(diào)控物質激活氧化迸發(fā)[22]以及外源施加SA對植物細胞內(nèi)H2O2的影響，如外源施加SA和稻瘟病菌誘導水稻細胞內(nèi) H2O2積累及激活防御反應機制[23]、SA誘導的H2O2參與的信號轉導途徑介導水稻根對鎘的耐受性[3]。有關 H2O2是否可以作為信號分子介導SA誘導的次生代謝物合成積累方面還知之甚少。

研究表明，以SA作為誘導子可以有效提高丹參培養(yǎng)細胞中Sal B的合成[24]。但對于外源施加的SA 是如何被丹參細胞內(nèi)的信號分子感受、傳遞并引起酚酸類化合物合成代謝的一系列過程還不清楚。目前報道的與植物細胞信號轉導有關的生理和生化事件，包括氧化迸發(fā)和活性氧積累、離子跨膜運輸、水楊酸的調(diào)控作用等有關的信號分子有Ca2+、IP3、NO及cGMP等[13]。但對與植物細胞內(nèi)次生代謝物合成有關的信號分子及其信號途徑之間的關系了解還不深入。本文以丹參懸浮培養(yǎng)細胞為材料，探討H2O2在介導SA誘導的丹參細胞Sal B合成積累過程中的作用，以期為進一步了解與植物細胞內(nèi)次生代謝物合成有關的信號分子及其信號轉導途徑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 丹參懸浮培養(yǎng)細胞系的建立及培養(yǎng)條件

丹參種子來源于陜西天士力植物藥業(yè)有限公司商洛丹參GAP藥源基地。

1.1.1 無菌苗的誘導

將新鮮丹參種子用自來水沖洗2~4 h，用紗布去除表面蠟質層，再用自來水沖洗3次，然后于無菌操作間滅菌。首先，在70%乙醇 (分析純，西安三浦化學劑公司) 中沖泡30 s，無菌水沖洗3次，然后在0.1% HgCl2(分析純，利祥汞業(yè)化工有限公司) 中滅菌 10~15 min，無菌水沖洗 3次，接種在 MS固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基中含有5.5 g/L 瓊脂 (北京康倍斯科技有限公司) 和30 g/L 蔗糖 (廣州市金華大化學試劑有限公司)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度 (25±2) ℃，光照時間12~16 h，光照強度2 000~3 000 Lx。培養(yǎng)2個月。

1.1.2 愈傷組織誘導

取出生長 2個月的無菌苗，將葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的小塊，接種于MS固體誘導培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基中含有1.0 mg/L NAA (天津博迪化工有限公司)、1.0 mg/L 6-BA (北京康倍斯科技有限公司)、1.0 mg/L 2,4-D (北京康倍斯科技有限公司)、5.5 g/L 瓊脂、30 g/L 蔗糖，在光照條件下誘導出愈傷組織。將愈傷組織每20 d繼代培養(yǎng)1次，2個月后其形態(tài)特征和生長速率穩(wěn)定。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度 (25±2) ℃，光照時間12~16 h，光照強度2 000~3 000 Lx。

1.1.3 懸浮細胞培養(yǎng)

取轉接后培養(yǎng)15 d的愈傷組織，按愈傷組織與培養(yǎng)液1︰15 (W/V) 的比例轉接到MS液體培養(yǎng)基上 (不含瓊脂和植物生長調(diào)節(jié)物質，含30 g/L蔗糖) 懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25 ℃，搖床轉速為125 r/min，黑暗培養(yǎng)。

1.2 誘導及處理方法

分別將H2O2(分析純，天津天力化學試劑有限公司)、DMTU (208-588-2，Sigma公司)、CAT (C-9322，Sigma公司)及IMD (B 0074，Sanland Chemical 公司) 溶液用 0.22 μm微孔過濾膜過濾，按照試驗要求向培養(yǎng)基中加入不同濃度的上述溶液。另一組培養(yǎng)細胞中加入等體積的蒸餾水 (代替H2O2、DMTU、CAT及IMD) 作為對照。各種處理試劑的添加時間為 SA誘導處理前30 min。

1.3 苯丙氨酸解氨酶 (PAL) 和酪氨酸氨基轉移酶 (TAT) 活性檢測

取新鮮培養(yǎng)材料，置定性濾紙上，用抽濾瓶抽去培養(yǎng)液后，迅速用蒸餾水沖洗，再用抽濾瓶抽去表面水分備用。

PAL活性的測定按文獻[25]的方法進行。在290 nm下測定吸光度，以每分鐘OD值變化0.01為一個酶活單位U。

式中，Vt：酶液總體積 (mL)；FW：樣品鮮重 (g)；Vs：測定時取酶液的體積 (mL)；n：反應液總體積 (mL)；t：反應時間 (h)。

TAT活性的測定按文獻[24]的方法進行。在331 nm下測定吸光度，以每分鐘OD值變化0.01為一個酶活單位U。

計算公式如下：

式中，Vt：酶液總體積 (mL)；FW：樣品鮮重 (g)；Vs：測定時取酶液的體積 (mL)；n：反應液總體積 (mL)；t：反應時間 (h)。

1.4 過氧化氫 (H2O2) 含量檢測

H2O2含量檢測采用硫酸鈦法[26]。稱取大約0.2~0.3 g的新鮮材料，加入5 mL 于4 ℃下預冷的丙酮 (分析純，成都科龍)，在冰浴下迅速研磨成勻漿，在4 ℃下10 000 r/min離心10 min。取2 mL上清液，加入 0.5 mL 5% 硫酸鈦(20044428，分析純，國藥集團) 混勻，再加入2 mL 濃氨水 (分析純，四川西隴) 混勻，在4 ℃下10 000 r/min離心10 min，棄去上清液。用5 mL 2 mol/L的濃硫酸 (分析純，四川西隴) 溶解沉淀，在波長415 nm處測定吸光度。

1.5 Sal B提取及含量檢測

樣品的制備：收獲丹參培養(yǎng)物，在1200 r/min離心后收集細胞，然后在47 ℃真空干燥箱中干燥至恒重。取0.05 g左右干燥細胞置具塞試管中，用 70∶30 (V/V) 的甲醇-水溶液超聲波提取45 min。提取液用 0.22 μm微孔濾膜過濾后待檢測。

Sal B 含量檢測采用高效液相色譜法(HPLC)[24]，檢測條件進行了適當修改。色譜條件為：色譜柱，shim-pack VP-ODS (250 mm×4.6 mm，i.d. 5 μm)；流動相，甲醇-水-冰乙酸 (體積比43︰56︰1)；流速，1 mL/min；進樣量，10 μL；檢測波長，281 nm；柱溫，30 ℃。

2 結果與分析

2.1 水楊酸誘發(fā)丹參培養(yǎng)細胞 H2O2釋放、PAL和TAT活化及Sal B合成

圖1 水楊酸誘導后丹參懸浮培養(yǎng)細胞中H2O2含量、PAL活性、TAT活性及Sal B含量變化Fig. 1 Time courses of H2O2 generation, the increase of PAL and TAT activity, as well as Sal B production of S. miltiorrhiza suspension cells treated with SA. 8-d-old cells treated with 22 mg/L SA were harvested at the time indicated, and the PAL and TAT activity, contents of H2O2 and Sal B were determined. Values are means of three independent experiments. The control received vehicle solvent only. Bars represented standard errors.

在水楊酸處理10 min后，丹參培養(yǎng)細胞中H2O2含量開始明顯增加，并在處理20 min時達到第1個峰值，隨后下降；在處理50 min時快速增加并在2 h左右達到第2個峰值 (圖1 A)。丹參培養(yǎng)細胞中PAL活性在誘導后30 min時出現(xiàn)第1個峰值，隨后大幅度下降；在4 h時快速增加并在16 h左右達到第2個峰值 (圖1 A)。TAT活性在處理后30 min開始上升，在50 min左右達到峰值，在4 h左右開始下降 (圖1 A)。丹參培養(yǎng)細胞中Sal B含量的升高稍晚于PAL活性的增加。在水楊酸處理8 h后細胞中Sal B的含量開始升高，在2 d左右達到最高 (圖1 B)。以上結果表明，水楊酸誘導的PAL活性及Sal B含量的升高均發(fā)生在 H2O2產(chǎn)生的峰值之后。說明H2O2可能在SA誘導丹參培養(yǎng)細胞Sal B合成積累的過程中起重要作用。

2.2 H2O2在丹參培養(yǎng)細胞PAL和TAT活化、Sal B合成過程中的作用

2.2.1 H2O2對培養(yǎng)細胞中PAL、TAT活性和Sal B含量的影響

用 H2O2水溶液單獨處理丹參培養(yǎng)細胞后發(fā)現(xiàn)，H2O2對細胞中PAL和TAT活性及Sal B含量均具有明顯的促進作用 (圖2)。

H2O2處理后，細胞中的PAL活性在20 min出現(xiàn)第1個峰值，隨后下降；處理1 h時，PAL活性快速增加，并在8 h達到第2個峰值。TAT活性在處理后30 min開始上升，在40 min達到峰值，在處理后4 h左右開始下降 (圖2 A)。

Sal B含量的升高稍晚于PAL和TAT活性的增加。H2O2處理8 h后，Sal B的含量開始增加，在處理1 d左右達到最高 (圖2 B)。

以上結果表明，H2O2處理后，培養(yǎng)細胞中PAL和TAT的活化及Sal B含量的升高均明顯比用SA單獨處理時 (圖1 A) 有所提前。說明丹參細胞對H2O2反應快于SA誘導。

2.2.2 培養(yǎng)細胞中酶活性變化和 Sal B合成對H2O2具有濃度依賴性

用不同濃度的 H2O2處理后，與對照相比丹參培養(yǎng)細胞中PAL和TAT的活化及Sal B含量的增加對H2O2具有濃度依賴性 (圖3)。

H2O2濃度在1~10 mmol/L范圍內(nèi)，與對照組(H2O) 相比，丹參細胞中PAL和TAT活性及Sal B含量的變化隨著 H2O2濃度的增加而增加；當H2O2濃度超過10 mmol/L時，對PAL和TAT活性及Sal B合成積累具有抑制作用。表明丹參培養(yǎng)細胞中PAL和TAT活性及Sal B合成積累對H2O2具有濃度依賴性，即低濃度的H2O2對Sal B合成積累具有促進作用，較高濃度的 H2O2對細胞造成傷害甚至殺死細胞，導致Sal B的合成積累受到抑制。

圖2 H2O2對丹參培養(yǎng)細胞PAL、TAT活性和Sal B含量的影響Fig. 2 Time courses of Sal B production and PAL and TAT activity of S. miltiorrhiza suspension cells treated with H2O2. 8-d-old cells treated with 10 mmol/L H2O2 were harvested at the time as indicated, and Sal B contents and PAL and TAT activity were then determined. Values are means of three independent experiments. Bars represented standard errors.

圖3 不同濃度的H2O2對丹參培養(yǎng)細胞PAL、TAT的活性和Sal B含量的影響Fig. 3 Effects of different H2O2 concentrations on PAL and TAT activity as well as Sal B production of S. miltiorrhiza suspension cells. 8-d-old cells treated with different concentrations of H2O2 were harvested 8 h, 16 h and 2 d later, and the TAT and PAL activity as well as Sal B contents were then determined. Values are means of three independent experiments. Bars represented standard errors. 1: H2O; 2: SA; 3: 1 mmol/L H2O2; 4: 10 mmol/L H2O2; 5: 30 mmol/L H2O2; 6: 50 mmol/L H2O2; 7: 70 mmol/L H2O2.

不同濃度的H2O2處理組與SA處理組相比，即使使用最適H2O2濃度 (10 mmol/L) 處理，丹參細胞中PAL和TAT活性及Sal B含量仍低于SA處理組，說明H2O2并不是SA誘導丹參細胞中Sal B合成積累的唯一信號分子，可能還存在其他途徑共同介導SA誘導丹參細胞中Sal B合成積累。

2.3 SA誘發(fā)Sal B合成及PAL和TAT的活化對H2O2具有依賴性

過氧化氫酶 (Catalase, CAT) 是一種分子量(240 kDa) 較大的H2O2清除劑，可以有效地清除細胞質膜外的H2O2[19]。二甲基硫脲 (DMTU) 是一種常用的H2O2淬滅劑[27]?；钚匝?(ROS) 可以通過質膜NADPH氧化酶把細胞質中NADPH的電子傳遞給O2從而形成然后通過歧化作用生成H2O2[29]。由質膜NADPH氧化酶產(chǎn)生的 H2O2作為信號分子已有很多報道[29-30]。在哺乳動物中性粒細胞中發(fā)現(xiàn)的NADPH氧化酶復合物的抑制劑二苯基碘 (DPI) 和咪唑 (IMD) 能夠抑制植物中由病原菌等誘導子誘導產(chǎn)生的H2O2的積累[14,31-32]。為了進一步證實H2O2是SA促進丹參細胞中PAL和TAT活化及Sal B合成所必需的信號分子，分別考查H2O2清除劑CAT、H2O2淬滅劑 DMTU和 NADPH氧化酶抑制劑IMD對SA處理下丹參懸浮細胞中PAL和TAT活化及Sal B合成的影響。

2.3.1 CAT在SA及外源施加H2O2誘導丹參培養(yǎng)細胞中H2O2產(chǎn)生及Sal B積累過程中的作用

100 U CAT單獨處理丹參培養(yǎng)細胞時，CAT組與對照組 (H2O) 相比，H2O2及Sal B含量均沒有明顯變化 (圖4)；當用CAT與22 mg/L SA或10 mmol/L H2O2聯(lián)合處理時，CAT對外源H2O2誘導的丹參培養(yǎng)細胞內(nèi)H2O2及Sal B的含量均具有消除作用，但不影響SA誘導丹參培養(yǎng)細胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生及Sal B的積累。這一結果說明，外源施加的CAT不影響SA誘導的丹參培養(yǎng)細胞內(nèi)H2O2產(chǎn)生及Sal B積累，但可以通過清除細胞外源H2O2從而消除H2O2引起的細胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生和Sal B的積累。主要是因為CAT是非細胞通透性分子，外源施加不能清除掉細胞內(nèi)的H2O2。

2.3.2 DMTU在外源施加SA及H2O2誘導丹參培養(yǎng)細胞中H2O2產(chǎn)生及Sal B積累過程中的作用

分別用100、500和700 μmol/L的DMTU單獨處理丹參培養(yǎng)細胞，與對照組 (H2O) 相比，當DMTU的濃度為100 μmol/L時，丹參培養(yǎng)細胞中H2O2及Sal B的產(chǎn)生受到抑制；當DMTU的濃度為500 μmol/L時，丹參細胞中H2O2及Sal B的含量極顯著降低 (圖5)；當DMTU的濃度為700 μmol/L時，細胞中H2O2及Sal B的產(chǎn)生被完全抑制 (數(shù)據(jù)未顯示)。

分別用100、500和700 μmol/L的DMTU與 22 mg/L SA或10 mmol/L H2O2聯(lián)合處理丹參培養(yǎng)細胞，500 μmol/L的DMTU明顯抑制了外源施加的H2O2對細胞內(nèi)H2O2及Sal B的誘導作用(圖5)；700 μmol/L的DMTU完全抑制了外源施加H2O2或SA對丹參細胞內(nèi)H2O2及Sal B的誘導作用 (圖中未顯示)。

以上結果表明，500 μmol/L的DMTU對丹參細胞內(nèi)H2O2及Sal B合成積累的抑制作用可以被外源施加的H2O2或SA所逆轉；DMTU對H2O2或SA誘導丹參培養(yǎng)細胞內(nèi)H2O2及Sal B的產(chǎn)生的抑制作用具有濃度依賴性。

圖4 CAT (100 U) 對SA (22 mg/L) 和外源H2O2 (10 mmol/L) 處理誘導丹參培養(yǎng)細胞產(chǎn)生H2O2及Sal B含量的影響Fig. 4 Effects of CAT (100 U) on H2O2 and Sal B content treated with SA (22 mg/L) and H2O2 (10 mmol/L). 8-d-old cells treated with CAT before SA treatment 30 min were harvested 8 h and 2 d later, and the H2O2 and Sal B contents were then determined. Values are means of three independent experiments. Bars represented standard errors.

圖5 DMTU對SA (22 mg/L) 和外源施加H2O2 (10 mmol/L) 處理誘導丹參培養(yǎng)細胞產(chǎn)生H2O2及Sal B含量的影響Fig. 5 Effects of different concentrations of DMTU on H2O2 and Sal B content treated with SA (22 mg/L) and H2O2 (10 mmol/L). 8-d-old cells treated with DMTU before SA treatment 30 min as indicated were harvested 8 h and 2 d later, and the H2O2 and Sal B contents were then determined. Values are means of three independent experiments. Bars represented standard errors.1: H2O; 2: SA; 3: H2O2; 4: 100 μmol/L DMTU; 5: 500 μmol/L DMTU; 6: 100 μmol/L DMTU+SA; 7: 500 μmol/L DMTU+SA; 8: 100 μmol/L DMTU+H2O2; 9: 500 μmol/L DMTU+H2O2.

2.3.3 IMD在外源施加SA及H2O2誘導丹參培養(yǎng)細胞中H2O2產(chǎn)生及Sal B積累過程中的作用

NADPH氧化酶是植物細胞內(nèi) H2O2產(chǎn)生的主要來源[14,33-34]。IMD是NADPH氧化酶特異性抑制劑，能夠有效抑制NADPH氧化酶活性[22-23]。前文證明了細胞內(nèi)的 H2O2由SA誘導產(chǎn)生且對Sal B合成積累具有一定的作用，為了進一步明確 H2O2為SA誘導產(chǎn)生的細胞內(nèi)的信號分子在誘導次生代謝物合成積累中的作用，用IMD抑制丹參培養(yǎng)細胞內(nèi) H2O2的產(chǎn)生，考察H2O2的作用。

用100~300 μmol/L的IMD單獨處理時，與對照組 (H2O) 相比，IMD可以有效抑制培養(yǎng)細胞中H2O2及Sal B的產(chǎn)生；用100 μmol/L的IMD與22 mg/L的SA或10 mmol/L的H2O2聯(lián)合處理時 (圖6)，100 μmol/L的IMD的抑制作用可以被外源施加的H2O2或SA逆轉。當IMD的濃度高于100 μmol/L時，IMD的抑制作用不會被外源施加的H2O2或SA逆轉 (圖中未顯示)。原因是當用較高濃度的IMD處理時，IMD通過抑制NADPH氧化酶活性從而抑制H2O2產(chǎn)生，而H2O2又是介導Sal B產(chǎn)生的信號分子，從而導致Sal B合成量降低；當用較高濃度的IMD與SA聯(lián)合處理時，由于NADPH氧化酶的活性完全被抑制，SA又無法誘導NADPH氧化酶活化，從而無法誘導H2O2產(chǎn)生，最終導致Sal B的合成積累受阻。

綜上所述，SA在誘導丹參培養(yǎng)細胞Sal B合成積累過程中依賴于 NADPH氧化酶產(chǎn)生的H2O2，H2O2在介導SA誘導Sal B合成過程中起著信號分子的作用。

圖6 IMD (100 μmol/L) 對SA (22 mg/L) 和外源施加H2O2 (10 mmol/L) 處理誘導丹參培養(yǎng)細胞產(chǎn)生H2O2及Sal B含量的影響Fig. 6 Effects of IMD (100 μmol/L) on H2O2 and Sal B content treated with SA (22 mg/L) and H2O2 (10 mmol/L). 8-d-old cells treated with IMD before SA treatment 30 min as indicated were harvested 8 h and 2 d later, and the H2O2 and Sal B contents were then determined. Values are means of three independent experiments. Bars represented standard errors.

3 討論與結論

在誘導子脅迫下，植物細胞可以活化多種生理和生化反應[13]，包括系統(tǒng)獲得抗性 (SAR) 和過敏反應 (HR)，衰老、細胞程序化死亡、氣孔關閉、細胞壁發(fā)育等[14]。其中通過過敏反應生成次生代謝物來緩解外界脅迫是植物細胞最典型的防衛(wèi)反應之一。SA作為誘導子可以有效提高丹參培養(yǎng)細胞中過氧化物酶 (POD)、多酚氧化酶(PPO) 及苯丙氨酸解氨酶 (PAL) 的活性[35]，而這些酶與植物抗逆性密切相關，是植物防衛(wèi)和生化反應的重要指標，酶活性的增高在一定程度上表征了植物細胞次生代謝能力的增強，有利于次生代謝產(chǎn)物的合成和積累。SA有效地誘導丹參培養(yǎng)細胞中與次生代謝相關的酶類，如 PAL和TAT活化及次生代謝產(chǎn)物咖啡酸和丹酚酸B的合成積累[24,35]。本研究觀察到，SA處理丹參培養(yǎng)細胞后，PAL和TAT活性均有所升高，二者在作用時間上互補，共同起著促進丹參培養(yǎng)細胞中Sal B合成積累的作用。

SA在誘導防御反應中的作用機制是通過上游調(diào)控活性氧水平 (如 H2O2含量) 來完成[22]，如外源施加SA可以有效誘導煙草和擬南芥葉片中H2O2的積累[22,36]。SA誘導丹參培養(yǎng)細胞Sal B合成積累過程中伴隨有抗氧化酶類如 POD、SOD、CAT活性的變化[24]，表明SA誘導Sal B積累過程中有活性氧的參與。本研究結果顯示，SA誘導丹參培養(yǎng)細胞中 H2O2的產(chǎn)生先于 PAL活化及 Sal B合成加強，說明丹參細胞中 H2O2的產(chǎn)生位于PAL活化和Sal B合成途徑激活的上游。這與Hung等[16]對ABA誘導水稻細胞花青素合成積累的研究結果相一致。

本實驗中，外源施加低濃度的 H2O2可以有效促進丹參培養(yǎng)細胞中PAL和TAT活化和Sal B的合成積累 (圖2)，表明H2O2是觸發(fā)丹參細胞中PAL和TAT活化及Sal B合成加強的充分條件，且Sal B的合成積累對H2O2具有濃度依賴性(圖3)，但即使是在最適H2O2濃度 (10 mmol/L)作用下，丹參細胞中Sal B含量仍低于SA處理組，且TAT活性升高起始于H2O2和PAL的第1個峰值出現(xiàn)之后，結束于H2O2第2個峰值出現(xiàn)之后 (圖1)，說明H2O2是介導Sal B合成的重要信號分子，但不是唯一的決定因子。在丹參細胞中除了 H2O2外，可能還存在著其他信號分子或信號途徑共同參與介導SA誘導丹參細胞中Sal B合成。

CAT是H2O2的有效清除劑，只能清除細胞外的H2O2，對細胞內(nèi)的H2O2沒有清除作用[4,13]。本實驗中，CAT對外源施加的H2O2誘導丹參培養(yǎng)細胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生及Sal B含量的積累具有消除作用，但不影響SA誘導丹參培養(yǎng)細胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生及Sal B的合成積累，說明CAT對丹參培養(yǎng)細胞內(nèi)H2O2產(chǎn)生及Sal B的合成并無作用，但是可以通過清除細胞外源 H2O2從而消除 H2O2對丹參細胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生和Sal B合成的促進作用。由于CAT不能透過細胞質膜，所以對SA誘導丹參細胞內(nèi)H2O2產(chǎn)生及Sal B合成積累沒有產(chǎn)生影響，進一步說明 H2O2是由SA誘導后在丹參細胞內(nèi)產(chǎn)生并起作用。

DMTU作為一種H2O2淬滅劑可以有效清除細胞內(nèi)的H2O2，如DMTU可以有效抑制ABA誘導水稻細胞中花青素的產(chǎn)生[28]。本實驗用500 μmol/L的DMTU處理可以抑制丹參細胞內(nèi)H2O2及Sal B的產(chǎn)生，且這種抑制作用可以被外源施加的 H2O2或 SA逆轉；但較高濃度(700 μmol/L) 的DMTU可以完全抑制外源施加的H2O2或SA對丹參細胞內(nèi)H2O2及Sal B的誘導作用，且抑制作用不可被 SA或H2O2逆轉，表明一定濃度的DMTU可以削弱H2O2或SA對丹參細胞中Sal B合成的誘導作用，說明SA誘導丹參培養(yǎng)細胞合成Sal B是通過H2O2所介導的信號轉導途徑。

NADPH氧化酶是植物細胞產(chǎn)生 H2O2的主要酶類[31,37]。IMD能夠有效抑制NADPH氧化酶的活性，從而抑制H2O2的產(chǎn)生。用0.1 mmol/L的IMD處理可以有效清除ABA誘導的水稻葉片中由NADPH氧化酶產(chǎn)生的H2O2[15]；100 μmol/L的IMD降低了ABA誘導的水稻葉片中花青素的合成，說明 H2O2可能作為信號分子介導花青素的合成[16]。本實驗用100 μmol/L IMD與22 mg/L的SA或H2O2聯(lián)合處理丹參培養(yǎng)細胞，發(fā)現(xiàn)IMD對細胞內(nèi)H2O2和Sal B的抑制作用可以被外源施加的H2O2或SA逆轉。當用濃度大于100 μmol/L的IMD處理時，IMD完全抑制了NADPH氧化酶的活性，以致完全阻斷了SA誘導Sal B的合成。說明IMD對丹參培養(yǎng)細胞內(nèi)Sal B合成積累的抑制作用依賴于由 NADPH氧化酶所產(chǎn)生的H2O2，H2O2作為信號分子在SA誘導丹參細胞合成Sal B中起重要作用。

綜上所述，水楊酸可以誘導丹參懸浮細胞中PAL和TAT活化、Sal B合成及H2O2產(chǎn)生，且水楊酸誘導丹參細胞中H2O2的產(chǎn)生先于PAL活化及Sal B合成加強，說明丹參細胞中H2O2的產(chǎn)生可能位于 PAL活化及 Sal B合成途徑激活的上游。外源H2O2單獨處理也能提高丹參細胞中PAL和TAT的活性及Sal B含量，表明H2O2是觸發(fā)丹參細胞中PAL和TAT活化及Sal B合成加強的充分條件。H2O2清除劑 CAT、H2O2的淬滅劑DMTU和NADPH氧化酶抑制劑IMD阻斷了水楊酸對丹參懸浮細胞中H2O2及Sal B合成的促進作用，又表明 H2O2是水楊酸誘導子誘發(fā)丹參細胞中Sal B合成加強的必要條件。但由于SA和外源H2O2在誘導丹參培養(yǎng)細胞Sal B合成積累過程中，H2O2的產(chǎn)生和TAT的活化沒有時間上的相關性，且即使在最佳濃度H2O2誘導下，H2O2誘導的Sal B的合成量也未達到SA處理組，說明丹參細胞中還存在著其他信號分子或其他信號途徑共同參與介導SA誘導Sal B合成積累。以上結果說明，H2O2是水楊酸促進丹參培養(yǎng)細胞中Sal B合成、PAL和TAT活化信號轉導途徑中所必需的信號分子，但不是唯一的信號分子。

REFERENCES

[1] The Chinese Pharmacopoeia Commission. Chinese Pharmacopoeia. Beijing: Chemical Industry Press, 2005: 53.中華人民共和國藥典委員會. 中國藥典. 北京:化學工業(yè)出版社, 2005: 53.

[2] Du GH, Zhang JT. Water-soluble phonetic compounds of Salvia miltiorrhiza advances in research of salvianolic acid. Bas Med Sci Clin, 2000, 20(5): 10?14.杜冠華, 張均田. 丹參水溶性有效成分——丹酚酸研究進展. 基礎醫(yī)學與臨床, 2000, 20(5): 10-14.

[3] Pellinen RI, Korhonen MS, Tauriainen AA, et al. Hydrogen peroxide activates cell death and defense gene expression in Birch. Plant Physiol, 2002, 130(2): 549?560.

[4] Kima SH, Kronstad JW, Ellis BE. Induction of phenylalanine ammonia-lyase activity by tryptophan in Ustilago maydis. Phytochemistry, 2001, 58(6): 849?857.

[5] Guo B, Liang YC, Zhu YG, et al. Role of salicylic acid in alleviating oxidative damage in rice roots (Oryza sativa) subjected to cadmium stress. Environ Pollut, 2007, 147(2): 743?749.

[6] Chen ZX, Silvia H, Klessig DF. Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid. Science, 1993, 262(5141): 1883?1886.

[7] Dat JF, Foyer CH, Scott IM. Changes in salicylic acid and antioxidants during induced thermo tolerance in mustard seedlings. Plant Physiol, 1998, 118(4): 1455?1461.

[8] Kang HM, Saltveit ME. Chilling tolerance of maize, cucumber and rice seedling leaves and roots are differentially affected by salicylic acid. Physiol Plant, 2002, 115(4): 571–576.

[9] Borsani O, Valpuesta V, Botella MA. Evidence for a role of salicylic acid in the oxidative damage generated by NaCl and osmotic stress in Arabidopsis seedlings. Plant Physiol, 2001, 126(3): 1024?1030.

[10] Metwally A, Finkemeier I, Georgi M, et al. Salicylic acid alleviates the cadmium toxicity in barley seedlings. Plant Physiol, 2003, 132(1): 272–281.

[11] Miao ZQ, Wei ZJ, Yuan YJ. Study on the effects of salicylic acid on tuxol biosynthesis. Chin J Biotech, 2000, 16(4): 509?513.苗志奇, 未作君, 元英進. 水楊酸在紫杉醇生物合成中誘導作用的研究. 生物工程學報, 2000, 16(4): 509?513.

[12] Zhang Y, Wang Y, Jiang SC, et al. Cloning of the differential expression fragment from ginseng culture induced by salicylic acid. Genomics Appl Biol, 2009, 28(2): 245?250.張悅, 王義, 蔣世翠, 等. 水楊酸誘導下人參培養(yǎng)物差異表達基因片段的克隆. 基因組學與應用生物學, 2009, 28(2): 245?250.

[13] Neill S, Desikan R, Hancock J. Hydrogen peroxide signalling. Curr Opin Plant Biol, 2002, 5(5): 388?395.

[14] Alvarez ME, Pennell RI, Meijer PJ, et al. Reactive oxygen intermediates mediate a systemic signal network in the establishment of plant immunity. Cell, 1998, 92(6): 773?784.

[15] Melillo MT, Leonettil P, Bongiovanni M, et al. Modulation of reactive oxygen species activities and H2O2accumulation during compatible and incompatible tomato-root-knot nematode interactions. New Phytol, 2006, 170(3): 501?512

[16] Hung KT, Hsu YT, Kao CH. Hydrogen peroxide is involved in methyl jasmonate-induced senescence of rice leaves. Physiol Plant, 2006, 127(2): 293?303.

[17] Levine A, Tenhaken R, Dixon RA, et al. H2O2from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response. Cell, 1994, 79(4): 583?593.

[18] Lee S, Choi H, Suh S, et al. Oligogalacturonic acid and chitosan reduce stomatal aperture by inducing the evolution of reactive oxygen species from guard cells of tomato and Commelina communis. Plant Physiol, 1999, 121(1): 147?152.

[19] Zhang X, Zhang L, Dong FC, et al. Hydrogen peroxide is involved in abscisic acid-induced stomatal closure in Vicia faba. Plant Physiol, 2001, 126(4): 1438?1448

[20] Li SW, Xue LG, Xu SJ, et al. Hydrogen peroxide involvement in formation and development of adventitious roots in cucumber. Plant Growth Regul, 2007, 52(2): 173?180.

[21] Xu MJ, Dong JF, Zhang XB. NO and H2O2signal interaction in the cell-mediated heat shock-induced synthesis of hypericin in Hypericum. Sci China (Ser C): Life Sci, 2008, 38(7): 643?653.徐茂軍, 董菊芳, 張新波. NO和H2O2在介導熱激誘發(fā)金絲桃細胞合成金絲桃素中的信號互作.中國科學(C 輯): 生命科學, 2008, 38(7): 643?653.

[22] Chen Z, Ricigliano JW, Klessig DF. Purification and characterization of a soluble salicylic acid-binding protein from tobacco. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90(20): 9533?9537.

[23] Ganesan V, Thomas G. Salicylic acid response in rice: influence of salicylic acid on H2O2accumulation and oxidative stress. Plant Sci, 2001, 160(6): 1095?1106.

[24] Dong J, Wan GW, Liang ZS. Accumulation of salicylic acid-induced phenolic compounds and raised activities of secondary metabolic and antioxidative enzymes in Salvia miltiorrhiza cell culture. J Biotechnol, 2010, 148(2/3): 99?104.

[25] Wan GW, Dong JE, Lang ZS, et al. Phenylalanine ammonia lyase (PAL) and polyphenol oxidase (PPO) activities of in vitro root under different culturing conditions in Salvia miltiorrhiza. Acta Bot Bor-Occident Sin, 2007, 27(12): 2417?2477.宛國偉, 董娟娥, 梁宗鎖, 等. 培養(yǎng)條件對離體丹參根苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性的影響. 西北植物學報, 2007, 27(12): 2471?2477.

[26] Li SW, Xue LG, Xu SJ, et al. Hydrogen peroxide acts as a signal molecule in the adventitious root formation of mung bean seedlings. Environ Exp Bot, 2009, 65(1): 63?71.

[27] Casano LM, Martín M, Sabater B. Hydrogen peroxide mediates the induction of chloroplastic Ndh complex under photooxidative stress in Barley. Plant Physiol, 2001, 125(3): 1450?1458.

[28] Kuo TH, Cheng DG, Hsu YT, et al. Abscisic acid-induced hydrogen peroxide is required for anthocyanin accumulation in leaves of rice seedlings. J Plant Physiol, 2008, 165(12): 1280?1287.

[29] Tanou G, Molassiltis A, Diamantidis G. Hydrogen peroxide- and nitric oxide-induced systemic antioxidant prime-like activity under NaCl-stress and stress-free conditions in citrus plants. J Plant Physiol, 2009, 166(17): 1904?1913.

[30] Wang J, Higins VJ. Nitric oxide modulates H2O2-mediated defenses in the Colletotrichum coccodestomato interaction. Physiol Mol Plant Pathol, 2005, 67(3/5): 131?137.

[31] Auh CK, Murphy TM. Plasma membrane redox enzyme is involved in the synthesis of O2-and H2O2by phytophthora elicitor-stimulated rose cells. Plant Physiol, 1995, 107(4): 1241?1247.

[32] Bestwick CS, Brown IR, Bennett MHR, et al. Localization of hydrogen peroxide accumulation during the hypersensitive reaction of lettuce cells to Pseudomonas syringae pv phaseolicola. Plant Cell, 1997, 9(2): 209?221.

[33] Desikan R, Cheung MK, Bright J, et al. ABA, hydrogen peroxide and nitric oxide signalling in stomatal guard cells. J Exp Bot, 2004, 55(395): 205?212.

[34] Potikha TS, Collins CC, Johnson DI, et al. The involvement of hydrogen peroxide in the differentiation of secondary walls in cotton fibers. Plant Physiol, 1999, 119(3): 849?858.

[35] Wan GW. Effect of elicitor on accumulation of salvianolic acid and secondary metabolism enzyme activities in Salvia miltiorrhiza Bunge callus[D]. Yangling: Northwest Agricultural and Forest University, 2008.宛國偉. 誘導子對丹參酚酸類化合物含量及合成酶的影響[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學, 2008.

[36] Rao MV, Paliyath G, Ormrod DP, et al. Influence of salicylic acid on H2O2production, oxidative stress, and H2O2-metabolizing enzymes: salicylic acid-mediated oxidative damage requires H2O2. Plant Physiol, 1997, 115(1): 137?149.

[37] Foreman J, Demidchik V, Bothwell JHF, et al. Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase regulate plant cell growth. Nature, 2003, 422(6930): 442?446.