陳吉裕，蒲志群，肖雅文，李翠萍，杜小兵，蘇承剛，張興國

南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 西南大學(xué)園藝園林學(xué)院, 重慶 400715

番茄紅素是抗氧化能力最強(qiáng)的一種類胡蘿卜素[1]，可預(yù)防心血管疾病、多種癌癥和一些慢性病發(fā)生，近年來成為醫(yī)學(xué)、營養(yǎng)學(xué)和食品學(xué)研究的熱點(diǎn)[2]。番茄和番茄制品是人們攝取番茄紅素的重要來源。然而，傳統(tǒng)育種和核轉(zhuǎn)基因途徑在豐量提高番茄的番茄紅素含量上均存在難度[3-4]。大量研究表明，質(zhì)體轉(zhuǎn)基因具有表達(dá)效率高、不存在共抑制和位置效應(yīng)、可多順反子表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)[5]。如果在番茄果實(shí)的質(zhì)體中建立一條與核基因同步表達(dá)的番茄紅素合成途徑，則可能突破提高番茄紅素含量的技術(shù)瓶頸。但番茄質(zhì)體轉(zhuǎn)化耗時(shí)長、難度大，而且真核基因要在質(zhì)體中表達(dá)，必須進(jìn)行原核化改造。由于質(zhì)體起源于藍(lán)細(xì)菌，除部分基因存在內(nèi)含子外，其基因的結(jié)構(gòu)與表達(dá)機(jī)制仍保留原核特性[6]；而且質(zhì)體基因可以在細(xì)菌中表達(dá)，細(xì)菌的啟動(dòng)子和終止子等控制元件也可以在質(zhì)體中行使功能[7]。因此，預(yù)先將原核化的番茄紅素合成基因在原核細(xì)胞中進(jìn)行功能驗(yàn)證，可以避免質(zhì)體轉(zhuǎn)化的技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。

利用大腸桿菌等原核生物發(fā)酵制備番茄紅素，具有高效和副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，已得到深入研究[8-9]。大腸桿菌不能合成進(jìn)入番茄紅素合成途徑的前體物質(zhì)牛兒基牛兒基焦磷酸(GGPP)，但能產(chǎn)生合成GGPP的前體物質(zhì)法尼基焦磷酸 (FPP)， 牻 牻故需導(dǎo)入包括 牛兒基 牛兒基焦磷酸合成酶基因在內(nèi)的多個(gè)外源基因才能塑建番茄紅素合成途徑[10]。目前應(yīng)用最多的是來自歐文氏菌Erwinia uredovora 牻的分別編碼 牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶、八氫番茄紅素合成酶和八氫番茄紅素脫氫酶的crtE、crtB和crtI基因[11]。不僅獲得了合成番茄紅素的高產(chǎn)菌株[10-12]，而且所建立的原核表達(dá)模式還可以用來驗(yàn)證新克隆的相關(guān)基因的功能[13-14]。除采用野生型crtE、crtB和crtI基因外，利用Lac乳糖操縱子[8]和T7/T7RNAP轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)[15]可以更高效地促進(jìn)和調(diào)控番茄紅素合成。由于真核化的 T7/T7RNAP系統(tǒng)是目前最具有發(fā)展?jié)摿Φ馁|(zhì)體轉(zhuǎn)基因高效表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)[16-17]，因此，本文利用T7/T7RNAP原核表達(dá)系統(tǒng)來驗(yàn)證由番茄LePSY1和LeGGPS2基因及歐文氏菌 crtI基因構(gòu)成的 T7::crtILeGGPS2-LePSY1::Ter多順反子結(jié)構(gòu)的功能。結(jié)果顯示，添加上核糖體結(jié)合位點(diǎn) (rbs) 的LePSY1和LeGGPS2的cDNA序列及crtI的編碼區(qū)序列，單獨(dú)或組合后受控于T7啟動(dòng)子和終止子，在含有T7RNAP基因的大腸桿菌菌株BL21 (DE3) 中能夠表達(dá)出預(yù)期大小的目的蛋白，且表達(dá)的LePSY1和LeGGPS2蛋白可協(xié)同crtI酶催化合成番茄紅素。該研究證實(shí)了原核化的 LePSY1和LeGGPS2基因的功能，獲得了利用 T7::crtILeGGPS2-LePSY1::Ter基因簇合成番茄紅素的大腸桿菌菌株，為今后利用該基因簇在番茄質(zhì)體中建立番茄紅素合成途徑奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄Solanum lycopersicon L. cv Ailsa Craig和含有crtI基因的pMD-crtI載體由重慶大學(xué)陳國平教授惠贈(zèng)。大腸桿菌菌株 XL1-Blue和 BL21 (DE3) 購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。載體pET32a (+) 購自Novagen公司。SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、柱式質(zhì)粒小抽提量試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，并委托該公司合成引物和測序。工具酶購自寶生物 (大連) 工程公司。IPTG (異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷) 為Sigma公司產(chǎn)品。其他所需試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 LeGGPS2、LePSY1和crtI基因的克隆及其表達(dá)載體構(gòu)建

用Plant RNAzol試劑 (鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司) 從番茄紅熟果實(shí)中提取總 RNA，經(jīng)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和Oligo (dT21)引物合成cDNA第一鏈。參照番茄品種Moneymaker 牻的 牛兒基牻牛兒焦磷酸合成酶基因 LeGGPS2 (GenBank Accession No. DQ267903) 序列設(shè)計(jì)PCR引物1和引物2，用PrimStar HS DNA聚合酶從cDNA中擴(kuò)增1 109 bp大小片段。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃變性2 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性10 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min 20 s，3個(gè)循環(huán)；95 ℃變性10 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min 20 s， 27個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物電泳分離和純化后，用NdeⅠ酶切20 h，再經(jīng)85 ℃水浴變性5 min后立即冰浴2 min，使切下的9 bp片段呈單鏈，而1 099 bp的片段保持雙鏈結(jié)構(gòu)；如此處理，既省時(shí)又避免電泳純化帶來DNA損失。將該酶切產(chǎn)物與pET32a(+) 載體經(jīng)Hind Ⅲ酶切后補(bǔ)平，再經(jīng)NdeⅠ酶切后電泳分離和純化的5 384 bp片段按3∶1的比例混合，用T4 DNA連接酶于 16 ℃連接 16 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，用引物2和引物3 (位于載體T7啟動(dòng)子的上游) 從Amp抗性平板上篩選 PCR產(chǎn)物為 1 202 bp大小的陽性克隆pT7-LeGGPS2 (6 483 bp)，再經(jīng)酶切和測序鑒定。

用引物 4和引物 5自 pMD-crtI中擴(kuò)增1 498 bp大小的八氫番茄紅素脫氫酶基因 crtI；PCR反應(yīng)條件為：95 ℃變性2 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性10 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min 30 s，3個(gè)循環(huán)；95 ℃變性10 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min 40 s，27個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化后，用NdeⅠ酶切，再經(jīng)變性使9 bp小片段單鏈化后，將1 489 bp的片段與上述pET32a (+)載體的酶切大片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，用引物5和引物3篩選PCR產(chǎn)物為1 592 bp大小的Amp抗性陽性克隆pT7-crtI (6 873 bp)，再經(jīng)酶切和測序鑒定。

參照番茄 Ailsa Craig的八氫番茄紅素合成酶基因LePSY1 (GenBank Accession No. Y00521、X60441和M84744) 序列設(shè)計(jì)引物6和引物7，自上述cDNA中擴(kuò)增1 248 bp大小帶；PCR反應(yīng)條件為：95 ℃變性2 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性10 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min 30 s，3個(gè)循環(huán)；95 ℃變性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，27個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化后，用NheⅠ酶切，再經(jīng)變性使8 bp小片段單鏈化后，將1 240 bp的片段與pT7-crtI載體經(jīng)Nde I酶切后補(bǔ)平、再經(jīng)Nhe I酶切后的5 394 bp片段相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，用引物7和引物3篩選PCR產(chǎn)物為1 352 bp大小的Amp抗性陽性克隆pT7-LePSY1 (6 634 bp)，再經(jīng)酶切和測序鑒定。

pT7-crtI載體經(jīng) NheⅠ和 XhoⅠ酶切后，回收6 850 bp大片段，與pT7-LeGGPS2的XbaⅠ和XhoⅠ酶切1 154 bp小片段相連，得到重組載體pT7-crtI-LeGGPS2。該載體經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ酶切后，回收7 984 bp大片段，與pT7-LePSY1的XbaⅠ和XhoⅠ酶切1 305 bp小片段相連，得到重組載體pT7-crtI-LeGGPS2-LePSY1。該載體經(jīng)Hind Ⅲ酶切，回收8 563 bp大片段，自環(huán)化后得到重組載體 pT7-crtI-LePSY1。其中，二價(jià)和三價(jià)基因表達(dá)載體同其單基因表達(dá)載體一樣，均由T7啟動(dòng)子和T7終止子 (Ter) 控制，且每個(gè)基因帶有獨(dú)立和相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn) (圖2A)。所有載體均經(jīng)過PCR擴(kuò)增和酶切鑒定。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 目的基因的原核表達(dá)分析

將 構(gòu) 建 的 pT7-LeGGPS2、 pT7-crtI、pT7-LePSY1、 pT7-crtI-LePSY1、 pT7-crtILeGGPS2-LePSY1和對(duì)照載體pET32a (+) 分別轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21 (DE3) 后，在LB含100 mg/L Amp培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，作為種子液。在初始表達(dá)條件下，即將種子液以1∶50接種于20 mL含Amp 100 mg/L的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌8 h后，加IPTG至20 μmol/L，30 ℃表達(dá)6 h離心收集菌體，觀察是否顯紅色，分析蛋白表達(dá)水平；對(duì)能產(chǎn)生番茄紅素的菌株進(jìn)行優(yōu)化發(fā)酵條件。

1.4 番茄紅素的提取及測定方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

按國標(biāo)GB/T14215-93方法，以蘇丹Ⅰ替代易被氧化的番茄紅素制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：A=0.2340C+0.0014，R2=0.9999；其中A為485 nm處的吸光度值，C為番茄紅素濃度。

1.4.2 菌液干重的測定

取菌液1 mL至已稱重 (精確至0.0001 g) 的1.5 mL離心管中，13 000 r/min離心3 min收集菌體，棄上清液，用滅菌水洗1次，105 ℃干燥至恒重，重復(fù)3次。所得質(zhì)量差為1 mL菌液的干重。

圖1 番茄紅素濃度與485 nm吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve between lycopene concentration and absorbance at 485 nm.

1.4.3 番茄紅素的提取與測定

收集2 mL菌液的菌體，用滅菌水洗1次，加 400 μL丙酮，黑暗中 50 ℃浸提 15 min，13 000 r/min離心10 min收集上清液，重復(fù)浸提1次。將提取液按適當(dāng)比例稀釋，測定在485 nm波長處的吸光度值。按所得回歸方程計(jì)算出番茄紅素量，以mg/g DCW (Dry cell weight) 單位表示。

1.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

取 5 mL過夜培養(yǎng)的菌液至 50 mL含100 mg/L Amp的LB培養(yǎng)基中再培養(yǎng)約8 h，以獲得足夠量的種子液。在相同種子液及初始表達(dá)條件 (同 1.3) 下摸索培養(yǎng)條件，均重復(fù)3次。

1.5.1 最佳誘導(dǎo)時(shí)期和表達(dá)時(shí)間的篩選

取種子液400 μL接入裝有20 mL附加3%蔗糖和 100 mg/L Amp的 LB培養(yǎng)基的三角瓶(100 mL) 中。分別在搖菌6 h、8 h、10 h、12 h時(shí)加IPTG至20 μmol/L，再于30 ℃誘導(dǎo)5 h，取樣提取番茄紅素，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)期。

采用上述方法接種，37 ℃搖菌8 h時(shí)加IPTG至20 μmol/L，再于30 ℃誘導(dǎo)3 h、5 h、7 h、9 h時(shí)取樣提取番茄紅素，確定最佳表達(dá)時(shí)間。

1.5.2 適宜碳源及其濃度的篩選

在LB培養(yǎng)基中分別添加30 g/L葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，篩選出適宜碳源。在含1%、3%、5%、7%適宜碳源的LB中，篩選出適宜的工作濃度。

1.5.3 適宜培養(yǎng)溫度的確定

搖菌8 h后加IPTG至20 μmol/L，分別在25 ℃、30 ℃、37 ℃誘導(dǎo)5 h，取樣提取番茄紅素，確定適宜的培養(yǎng)溫度。

1.5.4 培養(yǎng)基適宜pH值的確定

將加3%蔗糖的LB培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至6.4、6.6、6.8、7.0、7.2，搖菌8 h后加IPTG至20 μmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h后提取番茄紅素，確定適宜的pH值。

1.5.5 IPTG適宜濃度的篩選

搖菌8 h后分別添加IPTG至0、20、40、60、80、100 μmol/L，誘導(dǎo)5 h后，取樣提取番茄紅素，篩選最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。

1.6 SDS-PAGE電泳

將分別含pET32a (+) 與構(gòu)建的5個(gè)載體的菌株，用1.3所述方法于50 mL培養(yǎng)基和37 ℃培養(yǎng)8 h后，各取500 μL至1.5 mL滅菌離心管中作為非誘導(dǎo)對(duì)照，在剩余菌液中加 IPTG至0.5 mmol/L，兩者再同時(shí)于30 ℃誘導(dǎo)10 h。將誘導(dǎo)后的菌液于8 000 r/min離心10 min收集菌體，加5 mL PBS緩沖液洗1次，再離心棄上清液，加5 mL PBS緩沖液重懸，以功率為15%開3 s關(guān)4 s的方式于冰上超聲波破碎25 min。將破碎后的菌液于8 000 r/min離心10 min，取其上清1 mL至1.5 mL離心管中再經(jīng)16 000 r/min離心20 min，取10 μL作為上清液樣本；同時(shí)取其沉淀少量至新的離心管中，加10 μL無菌水，作為細(xì)胞碎片樣本。另外，將非誘導(dǎo)對(duì)照離心后，取少量沉淀加無菌水，作為未誘導(dǎo)樣本。將三者加上樣緩沖液后煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組載體與目的基因表達(dá)水平

測序結(jié)果顯示，crtI基因序列完全同預(yù)期；LeGGPS2與番茄品種Moneymaker的LeGGPS2有7個(gè)堿基的差異，所推導(dǎo)的氨基酸序列之間有2個(gè)殘基的不同；而LePSY1完全同M84744，但不同于Y00521和X60441的序列，且由pT7-crtI載體的NdeⅠ酶切補(bǔ)平端與引物6的5′端相連后，恢復(fù)NdeⅠ位點(diǎn)及該基因的翻譯起始密碼子ATG (序列略)。pT7-crtI-LePSY1、pT7-crtI-LeGGPS2和 pT7-crtI-LeGGPS2-LePSY1載體 (圖 2A) 經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切檢測，均鑒定為陽性 (結(jié)果略)。

圖2 載體結(jié)構(gòu)與目的基因的表達(dá)Fig. 2 Physical maps of vectors and the expression of the target genes. (A) Physical maps of the vectors. (B) Protein profiles of the gene expression from the five constructed vectors and pET32a(+) as a control. (C) IPTG induced lycopene synthesis. T7: T7 promoter; LeGGPS2: tomato geranylgeranyl pyrophosphate synthase gene 2; crtI: phytoene dehydrogenase gene of Erwinia herbicola; LePSY1: tomato phytoene synthesase gene 1; o (before the genes in the map): ribosome binding site; Ter: T7 terminator; M: protein molecular weight marker; 1?3: pET32a(+); 4?6: pT7-LeGGPS2; 7?11: pT7-LePSY1; 10?12: pT7-crtI; 13?15: pT7-crtI-LePSY1; 16?18: pT7-crtI-LeGGPS2-LePSY1; 1,4,7,10,13,16: whole cell lysates without IPTG induction; 2,5,8,11,14,17: soluble supernatants with IPTG induction; 3,6,9,12,15,18: insoluble cell debris with IPTG induction; a: pET32a(+); b: pT7-crtI-LeGGPS2-LePSY1.

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，對(duì)照pET32a(+) 無目的條帶，而分別含有 pT7-LeGGPS2、pT7-crtI、pT7-LePSY1、 pT7-crtI-LePSY1、 pT7-crtILeGGPS2-LePSY1載體的工程菌均有寬且亮的目的條帶 (箭頭所指)，說明目的蛋白均得到表達(dá)；其中，LeGGPS2、LePSY1和crtI表達(dá)的蛋白分別為39.019 kDa、46.745 kDa和54.839 kDa，均與預(yù)期大小相符。未誘導(dǎo)的與誘導(dǎo)后的菌體同樣有相應(yīng)的表達(dá)蛋白帶，但前者明顯比后者弱。各菌誘導(dǎo)后，3個(gè)目的基因表達(dá)的蛋白在沉淀中比在上清液中的帶要亮，說明有較多的目的蛋白形成了包涵體 (圖2B)。

發(fā)酵結(jié)果顯示，僅含 pT7-crtI-LeGGPS2-LePSY1的菌株經(jīng)誘導(dǎo)后收集的菌體呈紅色，而含其他載體的菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)后均為菌體本色(圖2C)，表明僅含有pT7-crtI-LeGGPS2-LePSY1的菌株能合成番茄紅素。

2.2 誘導(dǎo)時(shí)期和表達(dá)時(shí)間對(duì)番茄紅素含量的影響

表2可見，培養(yǎng)6 h時(shí)，即在工程菌處于對(duì)數(shù)生長中期時(shí)誘導(dǎo)，番茄紅素含量相對(duì)來說最低；培養(yǎng)8 h時(shí)誘導(dǎo)，番茄紅素含量最高，此時(shí)OD600值在3.00左右，且菌體生長處于對(duì)數(shù)生長后期；培養(yǎng)10 h和12 h時(shí)，菌體OD600值均接近5.00，即細(xì)菌生長處于穩(wěn)定期，此時(shí)誘導(dǎo)的番茄紅素含量雖比在對(duì)數(shù)生長中期誘導(dǎo)的番茄紅素含量多，但明顯比在對(duì)數(shù)生長后期誘導(dǎo)時(shí)的含量少。因此，含有pT7-crtI-LeGGPS2-LePSY1的工程菌表達(dá)番茄紅素時(shí)添加IPTG誘導(dǎo)的最佳時(shí)期為對(duì)數(shù)生長后期。

如表3所示，搖菌8 h時(shí)添加IPTG誘導(dǎo)后的0~5 h內(nèi)，番茄紅素含量隨時(shí)間延長而增加，且于5 h時(shí)達(dá)到最高，但隨后反而減少。這可能是由于誘導(dǎo)5 h后菌體衰老，代謝廢物增加，pH值改變，影響了番茄紅素合成和穩(wěn)定。因此，IPTG誘導(dǎo)5 h是最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

表2 誘導(dǎo)時(shí)期對(duì)番茄紅素含量的影響Table 2 Effects of the inducing phases on the lycopene content of the bacteria

表3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)番茄紅素含量的影響Table 3 Effects of the inducing time on the lycopene content of the bacteria

2.3 碳源及其濃度對(duì)番茄紅素含量的影響

由表4可見，工程菌在添加葡萄糖和麥芽糖的培養(yǎng)基中生長速度比在添加蔗糖中的快，但前兩者培養(yǎng)的菌體的番茄紅素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于以蔗糖為碳源的菌體的番茄紅素含量，故選擇蔗糖作為該工程菌的適宜碳源。

蔗糖含量從1%到5%時(shí)，每升菌液干重也隨之增長，但當(dāng)蔗糖含量到7%時(shí)，菌體干重反而減少，而番茄紅素含量以 3%蔗糖時(shí)為最高(表5)。

表4 不同碳源對(duì)番茄紅素含量的影響Table 4 Effects of different carbon sources on the lycopene content of the bacteria

表5 蔗糖濃度對(duì)番茄紅素含量的影響Table 5 Effects of sucrose concentration on the lycopene content of the bacteria

2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)番茄紅素含量的影響

表6顯示，30 ℃培養(yǎng)條件下，工程菌產(chǎn)生的番茄紅素量最高。25 ℃培養(yǎng)時(shí)菌體干重與在30 ℃時(shí)差別不大，但番茄紅素含量明顯偏低；37 ℃培養(yǎng)時(shí)的菌體最多，但番茄紅素含量最低。

表6 培養(yǎng)溫度對(duì)番茄紅素含量的影響Table 6 Effects of culture temperature on the lycopene content of the bacteria

2.5 培養(yǎng)基pH對(duì)番茄紅素含量的影響

工程菌在所設(shè)的5個(gè)pH值的培養(yǎng)基中均能正常生長，但pH在6.6以下時(shí)，不利于番茄紅素合成；pH 6.8時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量最高；pH值在7.0和7.2時(shí)略有降低 (表7)。

表7 培養(yǎng)基pH值對(duì)番茄紅素含量的影響Table 7 Effects of pH value of the medium on the lycopene

2.6 IPTG濃度對(duì)番茄紅素含量的影響

表8可見，IPTG不加時(shí)存在泄露；0~60 μmol/L范圍內(nèi)，番茄紅素含量隨IPTG濃度的增加而增加，至80 μmol/L時(shí)達(dá)到最高，但加至100 μmol/L時(shí)又降低。這可能和T7強(qiáng)啟動(dòng)子、酶的活性和可溶性有關(guān)。

表8 IPTG濃度對(duì)番茄紅素合成的影響Table 8 Effects of IPTG concentration on the lycopene content of the bacteria

3 討論

本研究將由 T7啟動(dòng)子控制的 LeGGPS2、LePSY1、crtI、crtI-LePSY1和 crtI-LeGGPS2-LePSY1基因 (圖2A) 分別轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21 (DE3) 菌株中，均能表達(dá)出預(yù)期大小的目的蛋白 (圖2B)，但僅crtI-LeGGPS2-LePSY1共表達(dá)時(shí)才能合成番茄紅素 (圖2C)，表明這3個(gè)基因的共表達(dá)盒構(gòu)建正確，而且真核基因LeGGPS2和LePSY1在組織結(jié)構(gòu)和表達(dá)方式上得到了正確的原核化轉(zhuǎn)換，所表達(dá)的蛋白具有預(yù)期的功能。由于原核細(xì)胞和植物質(zhì)體的基因表達(dá)機(jī)制具有相似性，因此，如果今后將 T7::crtI-LeGGPS2-LePSY1::Ter基因?qū)敕奄|(zhì)體，并通過整合進(jìn)核基因組的、表達(dá)后定位于質(zhì)體的T7RNAP專一性誘導(dǎo)表達(dá)，可望在番茄質(zhì)體中建立一條完整的番茄紅素合成途徑，促進(jìn)番茄紅素的合成。

本研究利用 T7::crtI-LeGGPS2-LePSY1::Ter基因在BL21 (DE3) 中和優(yōu)化的發(fā)酵條件下合成番茄紅素的最高含量為2.124 mg/g DCW。該水平雖然比 Matthews等直接利用野生型crtE-crtB-crtI基因簇獲得的 (160±32) μg/g DCW的產(chǎn)量高[18]，但比劉敏等采用T7/T7RNAP系統(tǒng)表達(dá)crtE-crtB-crtI基因簇獲得的5.8 mg/g DCW產(chǎn)量低[15]，更顯著低于 Alper等的 18 mg/g DCW[10]和Yuan等的22 mg/g DCW[12]。究其原因，既可能是由于T7/T7RNAP系統(tǒng)活性過強(qiáng)，所表達(dá)的LeGGPS2、LePSY1和crtI蛋白較多地形成了包涵體 (圖 2B)，也可能是由于合成番茄紅素的前體物質(zhì)FPP不足而引起的[18]。其中，前者的解決方法可以通過降低IPTG使用濃度或采用弱啟動(dòng)子以降低目的蛋白的表達(dá)水平，或改善目標(biāo)酶的可溶性；后者可以通過導(dǎo)入dxs[19]、idi[8]等基因來增加FPP量，或者按Vadali等的方式，在菌株中建立甲羥戊酸途徑以協(xié)同已存在的非甲羥戊酸途徑來促進(jìn)前體物合成[17]。此外，LeGGPS2和LePSY1在番茄中為質(zhì)體定位蛋白，在被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)質(zhì)體并切除質(zhì)體定位信號(hào)肽后方能成為成熟蛋白，但在本研究中是否由于原核表達(dá)未切除該信號(hào)肽而導(dǎo)致2個(gè)酶的活性及工程菌株合成番茄紅素的能力偏低，尚有待證實(shí)。

本研究結(jié)果顯示，菌體處于對(duì)數(shù)生長后期時(shí)用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)比較適合 (表2)，可能是因?yàn)樵摃r(shí)期的細(xì)胞處于“活力”最旺的時(shí)期，菌體生長、代謝和蛋白合成能力比較旺盛，中間代謝物比較穩(wěn)定，有豐富的代謝中間產(chǎn)物用于番茄紅素合成。這與Ruther等研究玉米黃素原核合成的結(jié)果相一致[20]。值得注意的是，在未添加IPTG誘導(dǎo)時(shí)，含T7::crtI-LeGGPS2-LePSY1基因的工程菌能表達(dá)一定量的目的蛋白 (圖 2B)，也能合成番茄紅素 (表8)，表明T7/T7RNAP表達(dá)系統(tǒng)存在泄露；這與劉敏等[15]利用帶有T7啟動(dòng)子和歐文氏菌crtE、crtB、crtI的BL21 (DE3) 表達(dá)番茄紅素情況相似。此外，本研究添加的IPTG濃度極低 (表8)，只需0.08 mmol/L即可，而高濃度的IPTG反而不利于合成番茄紅素。Kim等發(fā)現(xiàn)不添加IPTG的本底表達(dá)即可滿足合成番茄紅素所需蛋白，而添加IPTG后反而使得番茄紅素產(chǎn)量變低[8]。Yoon等也發(fā)現(xiàn)無 IPTG 誘導(dǎo)crtE-crtB-crtI表達(dá)合成的番茄紅素量是用0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)合成量的2倍[9]。這可能是由于目的蛋白表達(dá)過量或過快時(shí)容易形成包涵體所致 (圖2B)[8-11]。

本研究的工程菌在以蔗糖為碳源時(shí)，番茄紅素含量最高 (表 4)，但蔗糖濃度并非越高越好(表5)，這可能是因?yàn)椤捌咸烟切?yīng)”，即當(dāng)碳源濃度超過一定濃度，細(xì)胞反而會(huì)因?yàn)椤柏?fù)擔(dān)過重”，超過自身的氧化能力，從而抑制菌體生長或影響蛋白的表達(dá)[21]；此外，蔗糖含量過高會(huì)賦予培養(yǎng)基過高的滲透壓，影響細(xì)菌的生長和代謝。

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