任麗倩，李晶，畢玉海，陳璨，張大丙，劉文軍

1 安徽大學生命科學學院，安徽 合肥 230039

2 中國科學院微生物研究所 病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101

3 中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193

鴨甲型病毒性肝炎 (Duck virus hepatitis A)是危害雛鴨的一種急性、高致死性傳染病，具發(fā)病急、病程短、傳播快、病死率高等特點，主要侵害3周齡以內雛鴨，嚴重威脅養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展。該病已出現(xiàn)并流行半個多世紀，截至 2006年，研究人員測定出病毒的全基因組序列，標志著國內外對該病的研究已進入一個嶄新階段。該病毒目前存在較多變異株，國內外學者對其作了大量研究與分析。本文從鴨甲型病毒性肝炎的流行病學、分子遺傳進化、基因組結構功能等方面入手，闡述了鴨甲型病毒性肝炎常見的基因型及其臨床特征，最后分析出GenBank數(shù)據庫中鴨甲型肝炎病毒的分子遺傳與進化圖譜，并歸納出常見的監(jiān)測方式與預防措施，旨在為全面地分析該病毒特性、較好地預防該病發(fā)生提供直觀的評價指標和方法，為預防鴨甲型病毒性肝炎提供參考依據。

1 鴨甲型肝炎病毒的命名與溯源

目前，鴨甲型病毒性肝炎由鴨甲型肝炎病毒(DHAV) 引起。該病毒曾與鴨星狀病毒 (DAstV)統(tǒng)一被命名為鴨肝炎病毒 (DHV)，分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個血清型，均歸屬于小RNA病毒科。但根據2005年7月國際病毒分類委員會發(fā)表的最新病毒分類第八次報告，DHV-Ⅱ和DHV-Ⅲ應歸屬于星狀病毒科 (Astroviridae)[1]，且更名為DAstV-1、DAstV-2。

2007年，Tseng等[2]和Kim等[3]分別在臺灣和韓國鑒定出與DHV-Ⅰ無抗原相關性的新型；2008年，Wang等[4]基于VP1、VP0、VP3基因序列及3D基因的部分序列將DHV-Ⅰ分A、B、C三個基因型，分別對應血清Ⅰ型、臺灣新型和韓國新型。小 RNA病毒科研究小組建議在小RNA病毒科中增設禽肝炎病毒屬鴨甲型肝炎病毒種[5]，并將血清型DHV-Ⅰ的3個基因型歸屬其中。

本文將延用2008年后的分類，將引起鴨甲型病毒性肝炎的病毒歸屬于小RNA病毒科的禽肝炎病毒屬鴨甲型肝炎病毒種，稱之為鴨甲型肝炎病毒 (DHAV)。

2 鴨甲型病毒性肝炎的流行病學調查

鴨甲型病毒性肝炎自然爆發(fā)時，主要侵害3周齡以內雛鴨，死亡率可高達90%～95%。該病無明顯季節(jié)性，病鴨和帶毒鴨是主要傳染源，僅水平傳播，可通過消化道和呼吸道感染。易感鴨品種主要有櫻桃谷、北京鴨、櫻桃谷-北京雜、櫻桃谷與其他品種鴨的雜交鴨、番鴨、半番鴨、浙江麻鴨、美國水鴨等。

DHAV-A首次報道于 1945年美國長島。1954年Asplin和McLauch從英國病鴨中分離到該病毒，1957年Macpherson和Avery在加拿大分離出 DHAV-A[6]。其后德國、意大利、印度、法國、蘇聯(lián)、匈牙利、日本等國相繼報道了本病的流行。自印度、埃及分別報道了DHAV-A型的變異情況后，美國Sandhu等1992年利用雞胚中和試驗發(fā)現(xiàn)1株DHAV-A的變異株與DHAV-A僅有單向交叉中和反應，命名為Ia型[7]。

在我國，鴨甲型病毒性肝炎最早出現(xiàn)在上海地區(qū)，1980年王平等[8]在北京地區(qū)分離到了該病毒，1984年郭玉璞等[9]用熒光抗體間接法確定病原為 DHAV-A。近幾年，國內學者不斷從發(fā)病鴨中分離到DHAV-A的變異株：陳建紅等[10]報道稱珠江三角洲地區(qū)部分DHAV毒株的毒力與抗原性發(fā)生變異；蘇敬良等[11]從北京和廣西兩地分離的2株毒株均與DHAV-A型陽性血清無交叉免疫反應，將其暫定為新型鴨肝炎病毒，基因組序列測定表明該毒株與Kim報道的韓國新型同源性最高[12]；鄭獻進等[13]報道了DHAV-A型變異株的存在；范書才等1999年從廣東分離的 GD株病毒在血清學和抗原相關基因上與DHAV-A不同，屬新型[14]。為了解我國鴨甲型病毒性肝炎病毒的流行現(xiàn)狀情況，袁率珍等[15]對 1999?2010年從廣東、山東、云南、河南和黑龍江等地發(fā)病死亡雛鴨分離得到DHAV分離株進行血清型鑒定與抗原相關 VP1基因序列分析，結果表明目前 DHAV-A和DHAV-C 兩種基因型同時流行。Fu等[5]對2001?2007年分離自北京、內蒙古、重慶、廣東、上海5個地區(qū)的28個樣本基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其中13株是DHAV-A，15株是DHAV-C。何冉婭等[16]對 2007?2009年華南地區(qū)各鴨場發(fā)病雛鴨進行病原學檢測和VP1基因序列分析，結果顯示危害華南地區(qū)的鴨甲型肝炎病毒已發(fā)生變異，且存在DHAV-A、DHAV-C兩種基因型毒株的流行。此外，Liu等[17]在臨床表現(xiàn)為過度攝食、剖檢以肝病變?yōu)橹鞯牟※Z體內也分離到了DHAV-C毒株。

3 鴨甲型病毒性肝炎的臨床特征

3.1 臨床及病變特征

DHAV潛伏期為1~2 d，臨床表現(xiàn)主要是全身性抽搐，運動失調，兩腳痙攣，頭向后仰呈角弓反張狀，身體倒向一側或就地旋轉等神經癥狀；剖檢病變主要出現(xiàn)于肝臟，表現(xiàn)為腫大、質脆、色暗淡或發(fā)黃，表面有大小不等的出血斑或出血點。

3.2 組織病理變化

病理變化出現(xiàn)嚴重的肝壞死、炎性細胞滲出及膽管上皮細胞增生，非化膿性腦炎等變化。伍莉等[18]用DHAV-A感染雛鴨發(fā)現(xiàn)攻毒后12 h，肝、脾、腎及胰等器官組織以變性為主；攻毒后24 h呈現(xiàn)明顯的壞死性病變；攻毒后72~168 h，則出現(xiàn)較為明顯的增生性病變。

3.3 理化特征及生化指標

DHAV呈球形或類球形，直徑20~40 nm，無囊膜，無血凝性，胞漿內繁殖。DHAV耐酸(pH 3.0)，耐熱；對乙醚、氯仿、胰酶和常見消毒劑有抵抗力。

DHAV感染雛鴨的血清生化指標表現(xiàn)為血清中葡萄糖、總蛋白、白蛋白含量及谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶活性的變化有一定規(guī)律性，且自由基參與鴨甲型病毒性肝炎的致病過程。

4 鴨甲型肝炎病毒的分子遺傳與進化

GenBank數(shù)據庫中有49株DHAV-A全基因組序列，14株DHAV-C全基因組序列。系統(tǒng)進化分析顯示，DHAV-A可分成兩大支 (圖1)；毒株的進化規(guī)律與時間性和地域性沒有明顯的聯(lián)系；不同地域、國家之間存在進化地位十分相近的病毒，例如2007年越南疫苗株VXXT與94年韓國株DHV-HS、2005年臺灣株5886同在一個小分支，同源性分別為99.2%、95.4%，后兩者之間的同源性為 95.5%；2008年我國分離株LY0801與1995年韓國株DHV-HSS處于姊妹進化分支，同源性為94.3%；北京地區(qū)F、JX毒株與蘭州獸醫(yī)研究所分離的 HDHV1-HB、HDHV1-GD毒株親緣性較近，同源性分別為95.8%~99.8%。結果表明DHAV-A有可能在相鄰國家、地域間的鴨群中傳播。

圖1 DHAV-A基因型49株病毒全基因組系統(tǒng)進化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of complete genome of DHAV-A.

從DHAV-C型系統(tǒng)發(fā)育進化樹 (圖2) 可知，韓國分離株進化地位接近并形成獨立的一個小分支，中國分離株獨自形成一個分支；1999年分離株GD與2008年佛山分離株FS親緣較近；2010年7月劉明等自病鵝體內分離的毒株JT與廣東分離株C-GY處于姊妹進化分支，兩者之間同源性高達99.4% (圖3)，進化樹顯示DHAV-C有擴大感染譜從鴨向鵝傳播的趨勢。另外，2008年我國分離株B63與2009年越南株DN2獨成一支，且全基因組序列比對也顯示DN2和B63兩毒株與其他毒株差異較大，兩者之間差異最小，同源性達96%。

圖2 DHAV-C基因型核苷酸序列同源性分析Fig. 2 Homology analysis of DHAV-C strains.

圖3 DHAV-C基因型14株病毒全基因組系統(tǒng)進化分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of complete genome of DHAV-C.

5 鴨甲型肝炎病毒的基因組結構與功能

基因組全序列測定顯示 DHAV基因組是一種單股正鏈RNA分子，由5′非編碼區(qū) (5′ UTR)、開放閱讀框 (ORF)、3′非編碼區(qū) (3′ UTR)和ploy (A) 組成。到目前為止，研究人員所測基因組結構差異主要表現(xiàn)為是否存在L蛋白及2A蛋白的數(shù)目 (表2)。

5.1 開放閱讀框

開放閱讀框 ORF編碼的多聚蛋白在病毒包裝過程中，先自我切割形成P1、P2和P3前體蛋白，再由自身編碼的3C蛋白酶 (3 Cpro) 進行二級加工，最終被切割成12個成熟產物[22](圖4)。

表1 DHAV基因組結構Table 1 The genetic structure of DHAV

5.1.1 結構蛋白

在小RNA病毒中，結構蛋白VP0、VP3和 VP1位于病毒殼體的表面，參與病毒抗原位點的形成。王麗艷等[24]發(fā)現(xiàn)DHAV-A結構蛋白均存在類似其他小RNA病毒的八鏈反向平行β桶結構，氨基酸序列差異主要位于連接β片層的環(huán)區(qū)，而這些區(qū)域在其他小RNA病毒中是主要免疫原。

圖4 DHAV基因組結構示意圖[23]Fig.4 The schematic diagram of genetic structure for DHAV[23].

表2 非結構蛋白的結構和功能Table 2 The characteristics and functions of non-structural protein

近年研究發(fā)現(xiàn)在DHAV-A基因結構中VP0蛋白缺少被進一步水解成VP4和VP2的酶解位點[19-21]。劉燕等[25]最近研究發(fā)現(xiàn)VP3蛋白N端富含堿性氨基酸、約20 aa長的區(qū)域含有主要的抗原決定簇，能夠誘導機體發(fā)生免疫反應。

在小RNA病毒中，VP1蛋白作為主要的宿主保護蛋白，編碼主要的抗原位點并具有主要的型特異性中和位點[26]，是決定病毒抗原性的主要成分。DHAV-C與DHAV-A各基因的氨基酸序列比較得出結構基因以VP1的變異最為突出，源于DHAV-C的VP1較DHAV-A存在多個氨基酸的插入/缺失和位點突變。Jin等[27]對DHAV的序列進行分析，提示 VP1 是主要的抗原位點；范衛(wèi)國等[28]對其親水性、表面可能性及抗原指數(shù)等參數(shù)進行分析，認為位于VP1蛋白分子表面的區(qū)段最可能是B細胞表位的優(yōu)勢區(qū)段，而該區(qū)段恰是其變異位點。

5.1.2 非結構蛋白

隨著基因結構研究的深入，國內外學者對DHAV非結構蛋白的研究也取得了一定進展。

5.2 非編碼區(qū)

DHAV 5′UTR的IRES元件可起始下游蛋白的翻譯，且不受真核起始因子 (elF) 4F活性的影響[29]。趙偉等[30]通過點突變發(fā)現(xiàn)頸環(huán)結構SL1、SL2和Ⅲe區(qū)是維持IRES啟動內部翻譯起始功能的關鍵性結構域。3′UTR在小RNA病毒科中最長[31]；相比DHAV-A，DHAV-C 3′UTR的5′末端存在一段約50 nt的插入序列，加上其他區(qū)域的插入?缺失，使后者的3′UTR比前者長51 nt~52 nt。poly (A) 是合成負鏈RNA的模板，其長度與負鏈RNA的合成效率及病毒RNA的感染能力有關[32]。

6 鴨甲型肝炎病毒的診斷方法

臨床上診斷鴨甲型病毒性肝炎應注意與鴨瘟、番鴨細小病毒、雛鴨副傷寒、禽霍亂等進行區(qū)分。

6.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA

隨著單克隆抗體技術的成熟應用，ELISA成為重要的檢測方法之一。它簡便、快速、特異性強，敏感性高，重復性好，但單抗的供應尚未商業(yè)化，使其推廣受到了限制。馬秀麗等[34]和Liu等[35]用 VP1基因在大腸桿菌中表達，并以純化的重組蛋白為抗原建立鴨甲型病毒性肝炎抗體檢測ELISA法。

6.2 中和試驗

中和試驗是普遍認為的權威診斷方法，但其操作繁瑣、費時、成本高，不便于快速診斷，不適于臨床的推廣應用。Kaleta[37]和陳琨等[38]分別利用DHAV及其陽性血清在鴨腎、鴨胚肝細胞單層上進行微量血清中和試驗，用于病毒鑒定、疫病診斷和免疫監(jiān)測，敏感性高于鴨胚中和試驗。

6.3 其他方法

瓊脂擴散試驗簡便易行、易于推廣，但靈敏度不高且較易產生非特異性沉淀；凝膠試驗特異、靈敏、簡便、快速，卻由于非特異性凝血因子影響及不同批次制備的紅細胞在敏感性和穩(wěn)定性方面存在波動，限制了IHA推廣應用，早期建立的協(xié)同凝集試驗為測定 DHAV強弱毒株提供了一種簡便易行的方法；PCR操作簡單、快速、特異性強、靈敏度高、易標準化，且可以檢測病原體中特異性的核苷酸序列，多以 DHAV-A 3AB、3D、VP1基因保守序列設計引物建立[39-40]，目前已建立了 DHAV-A和 DHAV-C的鑒別RT-PCR、DHAV-A型巢式PCR和實時熒光定量RT-PCR；熒光抗體技術直觀、快速、敏感性高，可用于病原的檢測和鑒定，但費用和對設備的要求較高；免疫膠體金檢測技術簡便、快速、靈敏、直觀，亦對設備的要求較高，借此程安春等[39]觀察到病毒形狀；免疫組織化學法可用于DHAV在感染雛鴨組織細胞中的亞細胞定位和動態(tài)分布、DHAV感染雛鴨的實驗室診斷、甲醛固定組織的回顧性診斷，目前朱方偉等[41]觀察到DHAV-C的動態(tài)分布特點。

7 鴨甲型肝炎的防治與展望

近年來，鴨甲型病毒性肝炎的發(fā)生由DHAV引起，我國控制該病應主要針對DHAV的A型和C型采取措施。目前預防和治療DHAV的方法以高免卵黃抗體、高免血清、滅活苗、雞胚化弱毒疫苗為主。其中，高免卵黃抗體和血清對雛鴨被動免疫效果很好，兔抗鴨甲型肝炎病毒高免血清雞胚中和效價達1∶25以上；代長春[42]自制的卵黃抗體中和效價分別達1∶28、 1∶28.5以上，且均在感染強毒24 h以內對雛鴨進行肌肉注射治療效果最為理想。但血清制備較繁雜，成本高產量低，不易滿足生產需要，高免卵黃抗體存在鴨群散毒及卵黃抗體攜帶強毒的潛在危險。臨床上弱毒和滅活疫苗仍是預防該病最常用的方法，培育的DHAV-C 63代雞胚化弱毒疫苗對1日齡雛鴨安全無致病性，免疫劑量為 2.5×105.12個ELD50/只；蘇敬良等[43]獲得的DHAV-C第54代弱毒具有良好的免疫原性、毒力穩(wěn)定；Kim等[44]用SPF雞胚致弱的DHAV-C第100代弱毒株接種1日齡雛鴨，結果顯示疫苗保護力較好，毒力穩(wěn)定。

雖然鴨甲型病毒性肝炎在全球出現(xiàn)并流行了半個多世紀，近年來國內外學者多側重于雞胚致弱毒株的篩選和基因工程疫苗的研究，但目前國內尚無規(guī)范化的鴨甲型病毒性肝炎疫苗。

8 小結

鴨甲型病毒性肝炎的流行給水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失和嚴重威脅。隨著2006年DHAV-A全長基因組序列測定和報道后，國內外對該病毒的研究進入一個嶄新的階段和領域，從而開辟了DHAV分子生物學研究新方向，推動了病毒分類、基因組結構與功能、病毒與宿主之間的相互作用、分子致病機理等的研究。目前，我國DHAV及其變異株廣泛流行，迫切需要完善鴨甲型病毒性肝炎的流行病學資料，以尋求更加快速、便捷的分子流行病學監(jiān)測方法，研制新型疫苗，制定行之有效的標準化免疫診斷程序。

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