王玉穎，王鎮(zhèn)山，薛欣，聶大平

(1.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸內科，遼寧大連 116027;2.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院檢驗科，遼寧大連 116027)

MRSA對萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺體外誘導耐藥性比較

王玉穎1，王鎮(zhèn)山1，薛欣1，聶大平2

(1.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸內科，遼寧大連 116027;2.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院檢驗科，遼寧大連 116027)

［目的］通過比較萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺體外誘導耐甲氧西林金葡菌(methicillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA)前后的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)變化，探討此3種抗菌藥物在誘導耐藥性上有無差別。［方法］瓊脂二倍稀釋法檢測9株MRSA分別對萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺的MIC，篩選出2株對3種藥物均敏感的MRSA，用上述3種藥物分別誘導2株MRSA25代，最后檢測誘導后的MRSA菌株對3種藥物的MIC，應用統(tǒng)計學軟件進行數據分析。［結果］經萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺分別誘導25代后的MRSA菌株與各自誘導前比較，萬古霉素和利奈唑胺的MIC升高2倍，替考拉寧的MIC升高2.67倍，但各組間MIC變化無差別，均未見耐藥株產生;各組對照組的MRSA菌株經無藥平皿傳代，各藥對其MIC無變化。［結論］3種抗菌藥物在誘導MRSA耐藥上無差別。

MRSA;萬古霉素;替考拉寧;利奈唑胺;誘導耐藥

自20世紀60年代報道耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)出現開始，MRSA的感染率呈逐年上升趨勢，目前，MRSA感染已與HBV、AIDS列為世界范圍內三大難治感染性疾病，MRSA再次受到各國疾病控制中心的重視。MRSA呈現出的異質性及多重耐藥的特點為治療提出新的挑戰(zhàn)［1］。臨床常用的抗MRSA藥物有萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺。但近年國內外有關萬古霉素中介金黃色葡萄球菌(vancomycin－intermediate Staphylococcus aureus，VISA)、異質性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌(heterogennous vancomycin－intermediate Staphylococcus aureus，h－VISA)、萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌(vancomycin－resistant Staphylococcus aureus，VRSA)臨床分離株時有報道;國外已有關于耐利奈唑胺MRSA臨床分離株的報道;許多學者研究認為與抗菌藥物的選擇壓力有關。已有學者對MRSA進行萬古霉素體外誘導耐藥研究，發(fā)現VRSA不易誘導產生，但MRSA對萬古霉素的最低抑菌濃度有所提高，部分菌株轉變?yōu)?h－VISA［2－3］。本文通過比較萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺體外誘導MRSA前后的MIC變化，探討此3種藥物在誘導耐藥性上有無差別。

1 材料和方法

1.1 菌 株

收集2010年8月—2010年10月大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院臨床患者的血、痰、分泌物標本，經API－Staph系統(tǒng)鑒定為金黃色葡萄球菌9株。標準參考菌株為ATCC25923，由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 培養(yǎng)基及儀器

MH(A)培養(yǎng)基及胰蛋白胨大豆肉湯均為北京奧博星生物技術有限責任公司產品，批號分別為20061125和20070202;培養(yǎng)皿為青島金典生化器材有限公司產品;多點接種儀進口日本;恒溫培養(yǎng)箱為上海躍進醫(yī)療器械一廠產品。

1.3 藥 物

萬古霉素(vancomycin，VAN)為美國 Eli Lilly公司產品，批號為X－100651;替考拉寧(teicoplanin，TEI)為Sanofi Aventis公司的工作對照品，效價為92%;利奈唑胺(linezolid，LIN)為輝瑞公司產品，0.6 g∶300 mL，批號為 10c12z26;苯唑西林(oxacillin，OXA)為中國藥品生物制品檢定所產品。

1.4 方 法

1.4.1 MIC測定：采用瓊脂二倍稀釋法和多點接種器定量種菌進行藥敏實驗。凍存的9株金黃色葡萄球菌菌株接種于MH平皿，于37℃恒溫培養(yǎng)24 h后見菌落生長;分別將苯唑西林、萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺配制貯液，用MH肉湯2倍稀釋成各種所需濃度，分別加1 mL到平皿中，MH瓊脂培養(yǎng)基溶化后分別取19 mL注入含藥平皿中混勻，藥物終濃度分別為 0.008 μg/mL、0.016 μg/mL、0.032 μg/mL、0.064 μg/mL、0.125 μg/mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL、128 μg/mL、256 μg/mL;將實驗菌用MH肉湯配制成107cfu/mL接種于含藥平皿，于37℃恒溫培養(yǎng)24 h，無菌落生長的平皿中所含藥物濃度確定為MIC。各菌株對苯唑西林的MIC均＞4μg/mL，據美國臨床實驗室標準化委員會的(NCCLS)［6］瓊脂二倍稀釋法標準驗證9菌株均為MRSA;同時篩選出對萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺均敏感的2號和4號菌株作為誘導耐藥株。

1.4.2 誘導耐藥［2－5］：根據萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺分別對各菌株的MIC，將上述3種藥物分別配制成1/2倍MIC濃度的含藥MH平皿備用;將實驗菌接種于MH培養(yǎng)基后37℃恒溫培養(yǎng)24 h后見菌落生長，隨機取若干菌落分別接種于配制好的含藥平皿中37℃恒溫培養(yǎng)24 h后見菌落生長，依此反復培養(yǎng)25 d，同時菌株在無藥平皿中培養(yǎng)25 d，期間留取第 5代、10代、15代、20代、25代菌株于－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 誘導后菌株的MIC測定：采用瓊脂二倍稀釋法對第5代、10代、15代、20代、25代誘導后菌株測定分別對萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺的MIC。若藥物誘導后MIC＞4倍誘導前MIC則視為誘導產生耐藥，或者MIC升高達NCLS規(guī)定耐藥標準：萬古霉素和替考拉寧的MIC為4～16μg/mL則為中介耐藥，＞16μg/mL為耐藥;利奈唑胺無耐藥株標準。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 19.0軟件進行數據分析。組間計量資料比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MRSA分別對苯唑西林、萬古霉素、替考拉寧及利奈唑胺的MIC

各菌株對苯唑西林的MIC均＞4μg/mL，2號和4號對萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺均敏感，選擇這2種菌株作為誘導耐藥株。見表1。

表1 4種抗菌藥物對9株MRSA的MICTab 1 The MIC of 4 antibacterials to 9 MRSAs(μg/mL)

2.2 萬古霉素、替考拉寧及利奈唑胺對經萬古霉素誘導后MRSA的MIC

萬古霉素及替考拉寧對經萬古霉素誘導后MRSA菌株的MIC升高，但升高＜4倍;利奈唑胺對經萬古霉素誘導后MRSA菌株的MIC無變化。見表2。

表2 3種抗菌藥物對經萬古霉素誘導后MRSA的MICTab 2 The MIC of 3 antibacterials to MRSA after inducing of vancomycin (μg/mL)

2.3 萬古霉素、替考拉寧及利奈唑胺對經替考拉寧誘導后MRSA的MIC

萬古霉素及替考拉寧對經替考拉寧誘導后MRSA菌株的MIC升高，但升高＜4倍;利奈唑胺對經萬古霉素誘導后MRSA菌株的MIC無變化。見表3。

表3 3種抗菌藥物對經替考拉寧誘導后MRSA的MICTab 3 The MIC of 3 antibacterials to MRSA after inducing of teicoplanin (μg/mL)

2.4 萬古霉素、替考拉寧及利奈唑胺對經利奈唑胺誘導后MRSA的MIC

萬古霉素及替考拉寧對經利奈唑胺誘導后MRSA菌株的MIC無變化，利奈唑胺對經利奈唑胺誘導后MRSA菌株的MIC升高，但升高＜4倍。見表4。

表4 3種抗菌藥物對經利奈唑胺誘導后MRSA的MICTab 4 The MIC of3 antibacterials to MRSA after inducing of linezolid (μg/mL)

2.5 萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺分別誘導后的MRSA與誘導前比較

萬古霉素和利奈唑胺的MIC升高2倍，替考拉寧的MIC升高2.67倍;但各組間MIC變化比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。各對照組的MRSA菌株經無藥平皿傳代，各藥對其MIC無變化。見表5。

3 討論

自1961年Jevons在英國首次發(fā)現MRSA，到70年代末MRSA急劇增多幾乎遍及全球，80年代后期已成為全球性的病原微生物，居醫(yī)院感染病原菌的首位，占大型教學醫(yī)院分離金黃色葡萄球菌的60%～80%。MRSA呈現出的異質性及多重耐藥的特點為治療提出了挑戰(zhàn)［1］。目前常用的抗MRSA藥物主要是糖肽類及惡唑烷酮類抗菌藥物，臨床上常用的糖肽類有萬古霉素和替考拉寧，惡唑烷酮類為利奈唑胺。本文旨在通過上述研究幫助指導臨床上對這3種藥物的選擇。

表5 3種藥物分別誘導MRSA后的MIC與對照組比較Tab 5 The comparison of MIC of MRSA between after inducing of 3 antibacterials separately and control groups(μg/mL)

本研究顯示分別經過替考拉寧、萬古霉素誘導后的MRSA對兩種藥物的MIC與誘導前比較均升高，該結果歸因于同類抗菌藥物的作用機制相同;故在臨床選擇更換抗MRSA藥物時，應避免選擇同類抗菌藥物。而惡唑烷酮類藥物對經過糖肽類藥物誘導后的MRSA與誘導前比較MIC無變化，相反亦然，說明糖肽類抗菌藥物與惡唑烷酮類抗菌藥物間未見交叉耐藥，這與王敬華等［9］的研究結果一致。其主要原因是兩類藥物的抗菌機制完全不同，糖肽類抗菌藥物作用于細菌細胞壁，而惡唑烷酮類抗菌藥物作用于細菌的蛋白質合成。這給臨床上對于萬古霉素治療效果欠佳的患者更換利奈唑胺，或者應用利奈唑胺效果不滿意后更換成萬古霉素往往效果比較理想這一現象以理論支持。

經萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺分別誘導后的MRSA菌株與各自誘導前比較發(fā)現萬古霉素和利奈唑胺的MIC升高2倍、替考拉寧的MIC升高2.67倍，但均未高于4倍。同時據NCLS［6］對于金黃色葡萄球菌對萬古霉素、替考拉寧及利奈唑胺的耐藥標準，說明經3種藥物分別誘導后的MRSA菌株與誘導前比較均未見耐藥株的產生，這與Nunes APF等［3］認為體外萬古霉素不易誘導耐藥及Cazzola M等［10］認為體外利奈唑胺不易誘導耐藥的結果是一致的。同時該結果與萬古霉素應用于臨床半個世紀以來，目前仍是治療各種嚴重革蘭氏陽性菌感染，特別是MRSA及腸球菌屬所致感染的首選藥物的臨床事實相一致。分析糖肽類不易產生誘導耐藥的原因可能與糖肽類抗菌藥物除了抑制細菌細胞壁的合成以外，還可以改變細胞膜的通透性及選擇性抑制RNA的合成等多種抗菌機制有關。上述結果也解釋了利奈唑胺自問世以來一直被視為MRSA感染的治療有效藥物的原因。而惡唑烷酮類抗菌藥物不易產生誘導耐藥的原因可能與其獨特的抗菌機制有關：一方面能抑制mRNA與核糖體的結合，另一方面通過作用于核糖體50S亞基而阻止50S與30S亞基形成70S核糖體。除此之外，也可能與國內臨床應用時間短有關。有些學者的研究示經萬古霉素誘導后的MRSA少部分轉化為h－VISA，故推測上述3種藥物未見誘導耐藥株的產生也可能與傳代數較少有關。

比較3種藥物分別誘導前后的變化，P＞0.05說明誘導前后MIC的變化各組間無差別，提示3者誘導產生耐藥性無差異。分析其他方面的原因：(1)可能與菌株數量少有關;(2)可能與傳代數少有關。但同時發(fā)現2號菌株經萬古霉素誘導至20代MIC為4μg/mL，至25代為 2μg/mL，分析與抗菌藥物選擇壓力下的MIC不穩(wěn)定有關。但各對照組除替考拉寧的4號菌株外，經傳代后的MIC無變化，說明3種藥物對誘導前的MRSA菌株的MIC較穩(wěn)定。本研究為體外實驗，進一步仍需得到臨床療效的驗證。

［1］Chambers HF.Methicillin resistance in Staphylococci：molecular and biochemical basis and clinical implications［J］.Clin Microbiol Rev，1997，4：781－791.

［2］Kleinschmidt SL，MunckhofWJ，Nimmo GR.In vitro exposure of community－associated methicillin－resistant Staphylococcus aureus(MRSA)strains to vancomycin：does vancomycin resistance occur?［J］.Antimicrobial Agents，2006，27：168－170.

［3］Nunes APF，Teixeira LM，Iorio NLP，et al.Heteogeneous resistance to vancomycin in Staphylococcus epidermidis，Staphylococcus haemolyticus and Staphylococcus warneri clinical strains：characterization of glycopeptide susceptibility profiles and cell wall thickening［J］.Antimicrobial Agents，2006，27：307－315.

［4］葉高峰，馬蘭，魏華，等.MRSA對萬古霉素和去甲萬古霉素體外誘導耐藥性研究［J］.中華醫(yī)藥感染學雜志，1999，9(4)：196－198.

［5］Wacanakonakom C.In－vitro induction of resistance in Coaglase－negative Staphylococci to vancomycin and teicoplanin［J］.J Antimicrob chemother，1988，22(3)：321 －324.

［6］Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)/NCCLS).Performance standards for antimicmbial susceptibility testing：nighteenth informational supplement［S］.2009，M100－S19.

［7］Hiramatsu K，HankiH，Ino T，etal.Methicillin－resistant staphylococcus aureus clinical strain with reduced vancomycin susceptibility［J］.J Antimicrob Chemother，1997，40(1)：135－136.

［8］Hanaki H，Labischinski H，Inaba Y，et a1.Increase in glutaminenon－amidated muropeptidas in the peptidoglycan of vancomycin－resistant Staphylococcus aureus strain Mu50［J］.Antimicrob Agents Chemother，1998，42(3)：315 －320.

［9］王敬華，周惠琴，楊歡，等.利奈唑胺對h－VRS體外抗菌活性研究［J］.中國抗生素雜志，2009，34(9)：570－574.

［10］Cazzola M.Advances in the research and development of chemotherapeutic agents for respiratory tract bacterial infections［J］.Pulm Pharmacol Ther，2001，14(5)：367 －381.

Comparison on In－vitro Induction of Resistance in M ethicillin－resistance Staphylococcus Aureus to Vancom ycin，Teicoplanin and Linezolid

WANG Yu－ying1，WANG Zhen－shan1，XUE Xin1，NIE Da－ping2
(1.Department of Respiratory Medicine，2.Department of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China)

［Objective］The paper aims to explore the difference of vancomycin，teicoplanin and linezolid in the inducing resistance of MRSA bymeasuring MIC before and after drug inducing.［Methods］The MIC of Nine MRSA to vancomycin，teicoplanin and linezolid are identified by two－fold agar dilution method，and then two MRSA which are sensitive to the three drugs are found out.The two MRSA are induced separately by vancomycin，teicoplanin and linezolid for 25 generations.At last，the MIC ofMRSA which have been induced to vancomycin，teicoplanin and linezolid are identified.The data is analyzed by SPSS 19.0.［Results］After vancomycin，teicoplanin and linezolid inducing MRSA for 25 generations respectively，the MIC of vancomycin and linezolid increased 2 times and teicoplanin increased 2.67 times compared with those before drug induction.However，there was no difference of the change of MIC among the 3 groups.Additionally，no resistant strainswere generated.The MIC of3 drugs to MRSA strains in control groups in drug－free plates did not change after passage.［Conclusions］The comparison of the three drugs at inducing resistance have no significant difference.

MRSA;vancomycin;teicoplanin;linezolid;inducing resistance

R453.2

A

1671－7295(2012)03－0257－05

2011－12－29;

2012－03－20

王玉穎(1983－)，女，遼寧朝陽縣人，碩士研究生。E－mail：wangyuying7890@163.com

王鎮(zhèn)山，教授。E－mail：wzsdl@yahoo.com