孫衛(wèi)兵，楊 帆，齊清會

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，遼寧大連 116027;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧大連 116011)

電針次髎穴對慢性膀胱過度活動癥模型大鼠尿動力學(xué)及脊髓背角SP和CGRP影響

孫衛(wèi)兵1，楊 帆1，齊清會2

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，遼寧大連 116027;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧大連 116011)

［目的］探討電針次髎穴對環(huán)磷酰胺(cyclophsphamide，CYP)致慢性膀胱過度活動癥(overactive bladder，OAB)模型大鼠尿動力學(xué)及脊髓背角p物質(zhì)(substance P，SP)和降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin-gene related peptide，CGRP)的影響。［方法］雌性大鼠25只隨機分為對照組5只，OAB模型組10只，OAB+電針(電針組)10只。其中模型組和電針組動物腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)OAB，應(yīng)用膀胱測壓技術(shù)動態(tài)觀察電針次髎穴后排尿間期、基礎(chǔ)膀胱壓、膀胱最大充盈壓及最大排尿壓的變化;應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法定量觀察電針后脊髓背角SP和CGRP表達變化。［結(jié)果］電針組和模型組的排尿間期與對照組相比明顯縮短(P＜0.05)，基礎(chǔ)膀胱壓明顯升高(P＜0.01)。電針后電針組的基礎(chǔ)膀胱壓較模型組明顯降低(P＜0.01)，排尿間期較模型組明顯延長(P＜0.01)。與對照組相比，模型組脊髓后角SP及CGRP表達明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，電針組的脊髓后角SP及CGRP表達降低(P＜0.05)。［結(jié)論］電針次髎穴能抑制環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠膀胱過度活動，降低脊髓后角SP和CGRP的表達，電針次髎穴治療OAB可能與抑制膀胱傳入神經(jīng)的興奮性及傳入遞質(zhì)的釋放與合成有關(guān)。

電針;膀胱過度活動癥;P物質(zhì);降鈣素基因相關(guān)肽;尿動力學(xué)

正常的膀胱感覺功能是維持人體周期性儲尿和排尿的重要前提之一。近年研究表明，膀胱感覺功能異常在多種下尿路癥狀(low urinary tract symptoms，LUTS)的發(fā)生中起重要作用［1］。感覺增強會導(dǎo)致尿頻、尿急、尿痛和急迫性尿失禁等儲尿期癥狀，引起逼尿肌過度活動(detrusor overactivity，DO)，也是膀胱過度活動癥(overactive bladder，OAB)主要發(fā)病機制之一。而傳入性C纖維活動過度是逼尿肌反射亢進的關(guān)鍵病理機制［2］。

電針治療OAB在臨床上已被認可，本實驗采用腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺(CYP)誘導(dǎo)膀胱感覺異常的膀胱過度活動癥大鼠模型，通過檢測電針次髎穴前后大鼠尿動力學(xué)，L6脊髓背角P物質(zhì)(substance P，SP)和降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin-gene related peptide，CGRP)表達的變化探討電針對膀胱儲尿功能的影響及可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

健康、雌性、無孕史 SD大鼠25只，體重約在180～220 g，由大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號:SCXK(遼)2008-0002。將大鼠隨機分成對照組(5只)，模型組(10只)和電針組(10只)，實驗過程中對動物的處置符合國家頒布的有關(guān)善待實驗動物的指導(dǎo)性意見要求。兔抗CGRP多克隆抗體(AB8056，abcam)兔抗 SP多克隆抗體(AB1566，CHEMICON INTERNATIONAL)。

1.2 膀胱過度活動模型的建立［6］

模型組及電針組小鼠腹腔內(nèi)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)，建立膀胱過度活動模型。環(huán)磷酰胺的劑量為75 mg/kg，1次/3 d，共兩周。對照組用相同容量的生理鹽水注射，注射時間與模型組相同。

1.3 電針治療方法

按照比較解剖和骨度分寸法為依據(jù)進行穴位定位。大鼠次髎穴(骶3孔)的定位:脊髓骶椎2、3節(jié)段旁開約0.5 cm處，不銹鋼毫針以直插所選部位，進針約30～40 mm，接電針儀。刺激頻率為20 Hz，連續(xù)波，針刺時間60 min。

1.4 尿動力學(xué)檢查方法及檢查指標

大鼠腹腔注射烏拉坦(1.0 g/kg)麻醉，大鼠尿道內(nèi)插入F3導(dǎo)管，接三通管，其中一端接尿動力儀的膀胱壓力傳感器，體內(nèi)置零;另一端接微量泵，以0.2 mL/min的速度向膀胱內(nèi)灌注室溫下生理鹽水，至大鼠開始排尿時停止注水，連續(xù)測定3個排尿周期，測定排尿間隔時間、基礎(chǔ)膀胱壓、膀胱最大充盈壓、最大排尿壓。

1.5 分組檢測

模型組:CYP誘導(dǎo)膀胱過度模型后行第1次尿動力學(xué)檢測，連續(xù)測定3個排尿周期，1 h后重復(fù)進行第2次尿動力學(xué)檢測。

電針組:CYP誘導(dǎo)膀胱過度模型后行第1次尿動力學(xué)檢測，連續(xù)測定3個排尿周期，電針60 min后行第2次尿動力學(xué)檢查。

對照組:尿動力學(xué)檢測同模型組。

1.6 組織取材處理、觀察指標及方法

組織取材:大鼠腹腔注射烏拉坦(1.0 g/kg)維持麻醉，迅速打開胸腔，立即左心室-主動脈插管，右心耳切開，20℃的生理鹽水100 mL快速灌注沖洗后，再灌注室溫的4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS配制)400～500 mL約1 h，取L6-S1段的脊髓(長約1 cm)，置于4℃、4%多聚甲醛中外固定20 h，轉(zhuǎn)入4℃、30%蔗糖溶液(0.1 mol/L PBS配制)過夜，待標本檢測。

免疫組織化學(xué)程序:(1)冰凍切片，標本冰凍切片，厚度為20 μm，并且以每20取4片的方法取片;(2)脊髓后角切片采用免疫組化 ABC法行 SP、CGRP染色，依次加入一抗、二抗孵育，顯色劑染色及復(fù)染、封片。

計算機圖像分析:Imageproplus圖像分析系統(tǒng)進行分析，每張切片觀察3個視野，計算平均吸光度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

計量資料表示為均數(shù)±標準差(±s)，采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，組間比較Oneway ANOVA方差分析，運用GLM過程，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 治療前后尿動力學(xué)參數(shù)變化

治療前電針組和模型組的排尿間期與對照組相比明顯縮短(P＜0.05)，基礎(chǔ)膀胱壓明顯升高(P＜0.01)。治療后電針組基礎(chǔ)膀胱壓較模型組明顯降低(P＜0.01)，排尿間期較模型組明顯延長(P＜0.01)，見表1。

表1 治療前后尿動力學(xué)參數(shù)比較Tab 1 Compare urodynamic parameter before and after treatment (±s)

表1 治療前后尿動力學(xué)參數(shù)比較Tab 1 Compare urodynamic parameter before and after treatment (±s)

1)與對照組相比，P ＜0.05;2)與對照組相比，P ＜0.01;3)與模型組相比，P ＜0.01

模型組(n=10) 電針組(n=10) 對照組(n=5)排尿間期(min)第 1 次 9.1 ±1.11) 9.7 ±1.51) 13.9 ±1.3第 2 次 10.2 ±1.6 13.2 ±1.13) 14.2 ±1.2基礎(chǔ)膀胱壓(cm H2O)第 1 次 15.2 ±2.22) 13.1 ±2.12) 8.9 ±1.4第 2 次 14.6 ±1.3 10.8 ±1.43) 9.4 ±1.3最大膀胱充盈壓(cm H2O)第 1 次 23.4 ±3.3 22.3 ±2.6 18.3 ±1.7第 2 次 21.8 ±3.4 24.8 ±3.2 17.9 ±1.4最大排尿壓(cm H2O)第 1 次 49.2 ±3.7 39.4 ±3.1 40.7 ±3.3第2次47.3 ±3.2 36.5 ±3.7 42.3 ±3.4

2.2 骶髓排尿中樞SP及CGRP表達變化

模型組骶髓排尿中樞SP及CGRP表達較對照組明顯升高(P＜0.05);電針組的骶髓排尿中樞SP及CGRP表達比模型組降低(P＜0.05)，電針可以降低逼尿肌反射亢進大鼠骶髓排尿中樞 SP及CGRP 的表達，見表2，圖 1、2。

表2 脊髓后角I、II層中SP、CGRP陽性纖維和終末平均光密度(A值)Tab 2 Mean optical density of SP，CGRP positive fibers in laminaeⅠ，Ⅱ in dorsal horn of sacral cord (±s)

表2 脊髓后角I、II層中SP、CGRP陽性纖維和終末平均光密度(A值)Tab 2 Mean optical density of SP，CGRP positive fibers in laminaeⅠ，Ⅱ in dorsal horn of sacral cord (±s)

1)與對照組相比，P ＜0.05;2)與模型組相比，P ＜0.05

SP CGRP模型組 1.16 ±0.191) 1.28 ±0.161)電針組 0.86 ±0.122) 0.92 ±0.092)對照組0.76 ±0.11 0.85 ±0.10

圖1 大鼠脊髓背角P物質(zhì)表達的影響Fig 1 Influence of electroacupuncture on expression of substance P in the dorsal horn of spinal cord

圖2 大鼠脊髓背角CGRP表達的影響Fig 2 Influence of electroacupuncture on expression of CGRP in the dorsal horn of spinal cord

3 討 論

DO是引起膀胱過度活動癥的主要原因，目前對OAB的基礎(chǔ)研究幾乎完全以DO為基礎(chǔ)來進行，且主要集中在逼尿肌方面的研究。抗膽堿藥物治療臨床上未能取得滿意的療效，說明阻斷傳出神經(jīng)抑制逼尿肌過度活動并不是解決OAB癥狀的唯一途徑，因此目前許多學(xué)者開始研究膀胱傳入神經(jīng)的作用。

電針次髎穴治療OAB臨床上已取得較滿意的療效。次髎穴位于第2骶后孔，骶神經(jīng)都從骶后孔通過，對次髎穴進行針刺加電刺激干預(yù)和骶神經(jīng)調(diào)節(jié)有相似的作用。針刺治療逼尿肌過度活動的作用機制目前尚不十分明確。動物實驗顯示:針刺通過抑制儲尿期副交感排尿中樞的興奮性，從而降低逼尿肌的緊張性收縮;也有學(xué)者研究證實:針刺能抑制膀胱傳入神經(jīng)的興奮性來抑制逼尿肌過度活動［3-4］。然而這些逼尿肌活動亢進的動物模型中多為L-多巴誘發(fā)的模型，脊髓橫斷模型等。但上述模型均不是由膀胱病變引起傳入神經(jīng)功能異常有關(guān)的動物模型，不能直接證明電針具有降低傳入神經(jīng)興奮性的作用。

動物實驗中應(yīng)用不同的化學(xué)浸潤性物質(zhì)可導(dǎo)致膀胱的過度活動，環(huán)磷酰胺是最常用的一種。腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺可誘導(dǎo)大鼠膀胱產(chǎn)生出血性膀胱炎，通過C纖維引起膀胱的疼痛和刺激使排尿頻率的增加，排尿膀胱容量的減少，最大排尿壓力的減少以及膀胱基礎(chǔ)壓的增加，是與膀胱感覺異常有關(guān)的逼尿肌活動亢進的理想動物模型［5］。電針對這類動物模型排尿功能的影響尚未見文獻報道。

本實驗結(jié)果顯示:與對照組相比，環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的膀胱過度活動癥大鼠排尿頻率增加，膀胱基礎(chǔ)壓明顯增高。電針“次髎穴”60 min后排尿頻率顯著減少，膀胱壓明顯下降。電針次髎穴對環(huán)磷酰胺致大鼠逼尿肌活動亢進有明顯的抑制作用。

近年來C類傳入纖維作用在OAB的作用越來越受到關(guān)注。腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺可誘導(dǎo)大鼠膀胱產(chǎn)生出血性膀胱炎，通過C纖維引起膀胱逼尿肌的過度活動。正常膀胱存在的感覺纖維主要分為Aδ類和C類，Aδ類為有髓鞘快傳輸纖維而C類傳入纖維為無髓鞘的慢傳輸型神經(jīng)纖維。膀胱的傳入神經(jīng)(健康脊髓)的興奮主要由Aδ類纖維介導(dǎo)，Aδ纖維通過脊髓將信息傳到腦干，然后傳遞至中腦水管周圍的灰質(zhì)，最后將膀胱充盈情況傳遞到腦橋排尿中樞Aδ纖維對膀胱的被動收縮和主動收縮都敏感。C類纖維其數(shù)量占膀胱傳入纖維的60.0% ～70.0%，生理情況下只在膀胱高度充盈時C纖維才被激活。然而，這些纖維可被膀胱粘膜的化學(xué)性刺激或者冷刺激激活。在化學(xué)性刺激作用下，C纖維表現(xiàn)為膀胱空虛時自發(fā)放電，膀胱充盈時放電增強［7］。膀胱內(nèi)注射辣椒素使C纖維脫敏，膀胱過度活動可被抑制，但是并沒有抑制正常大鼠的排尿反射，這表明C纖維傳入通路對正常排尿反射是非必須的［8］。有學(xué)者研究表明:電針骶部穴位能降低髓髓排尿中樞c-fos的表達，表明C纖維活動受到抑制，推測這可能是電針治療逼尿肌反射亢進的機制之一［4］。

在脊髓中CGRP主要存在于小C纖維，Aδ類纖維的初級傳入神經(jīng)中，而外周傷害性刺激信息主要是由小C纖維，Aδ類纖維傳遞。大部分CGRP免疫反應(yīng)陽性物神經(jīng)分布于脊髓表層的兩個脊髓背角。該部位也含有豐富的SP，其中一部分來源于脊髓背根感覺神經(jīng)節(jié)的無髓C纖維，是傷害性初級傳入末梢釋放的一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，存在于脊髓RexedⅠ層和II層的Aδ和C纖維上。外周性傷害刺激這些傳熱纖維可通過背角板層Ⅰ和Ⅱ的中間神經(jīng)元相互作用，將神經(jīng)肽遞質(zhì)SP背根神經(jīng)節(jié)傳送至脊髓背角，引起脊髓背角SP的釋放。脊神經(jīng)節(jié)細胞內(nèi)合成后運輸?shù)礁杏X神經(jīng)末梢，并在化學(xué)性刺激下或疼痛感覺時釋放。CGRP與P物質(zhì)(SP)共存于DRG的初級傳入神經(jīng)元中。CGRP可以抑制與SP降解有關(guān)的SP內(nèi)肽酶，使SP的作用增加或延長。

目前有實驗證實環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的膀胱炎膀胱傳導(dǎo)通路中CGRP或SP表達上調(diào)。支配膀胱及尿道的背神經(jīng)根神經(jīng)節(jié)細胞體或突起中含有大量的神經(jīng)肽類，PS和CGRP廣泛分布在這些細胞中。環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)慢性膀胱炎模型中CGRP和SP-IR在與排尿反射有關(guān)的脊髓節(jié)段和背神經(jīng)根神經(jīng)節(jié)(L6，S1)中增高。椎管內(nèi)注射SP拮抗劑能減少膀胱逼尿肌過度活動，能增加清醒狀態(tài)下大鼠的膀胱容量，排尿壓無明顯改變。CGRP和SP-IR膀胱傳入神經(jīng)細胞中樞和外周投射系統(tǒng)表達增加有助于這種過度活動的形成［9］。近年來研究醋酸西唑來汀，脊髓水平的CGRP和SP抑制劑，能明顯抑制尿動力診斷逼尿肌過度活動病人尿急和尿失禁癥狀［10］。

本實驗結(jié)果顯示:模型組大鼠脊髓背角內(nèi)SP、CGRP免疫陽性神經(jīng)元均明顯增加(P＜0.01)。電針60 min后大鼠膀胱內(nèi)SP免疫陽性神經(jīng)元較模型組明顯減少(P＜0.01)。推測電針次髎穴有可能通過抑制 Aδ和 C類傳入纖維投射所釋放的 SP、CGRP，減少感覺信號的傳遞，從而抑制逼尿肌過度活動。

神經(jīng)肽類表達的變化及在中央終端的釋放導(dǎo)致控制排尿脊髓環(huán)路重建，這種重建包括以下幾種變化:(1)脊髓排尿反射的突觸組合;(2)特殊神經(jīng)元單元的化學(xué)受體編碼(初級傳入神經(jīng)元，中間神經(jīng)元);(3)上行和下行脊髓反射投射組合方面。Aδ和C類傳入纖維與脊髓背角傷害性感受神經(jīng)元之間的突觸傳遞不僅可以強化，也可以產(chǎn)生長時程的抑制制(long-term depression，LTD)。給外周傳入纖維不同的條件刺激，在脊髓背角能產(chǎn)生不同的突觸傳遞可塑性變化。如對Aδ傳入神經(jīng)纖維進行低頻條件電刺激，在初級傳入纖維與脊髓背角傷害性感受神經(jīng)元之間形成的突觸傳遞則誘發(fā)LTD，而對C纖維進行高頻強直性條件電刺激則誘發(fā)LTD［11］;本實驗采用高頻電針治療，其作用機制可能與抑制C纖維的突觸傳遞抑制有關(guān)。

本研究結(jié)果提示，電針次髎穴可通過降低脊髓后角SP和CGRP的表達來抑制傳入神經(jīng)的興奮性及傳入遞質(zhì)的合成與釋放、抑制C纖維的突觸傳遞而影響脊髓排尿環(huán)路、抑制逼尿肌過度活動降低膀胱基礎(chǔ)壓及降低排間期等方式治療OAB。

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Urodynamic effects of electroacupuncture at Ciliao on overactive bladder in rats and CGRP，SP expressions of dorsal horn of spinal cord

SUN Wei- bing1，YANG Fan1，QI Qing - hui2
(1.Department of Urology，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China;2.Department of General Surgery，the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116011，China)

Abstract:［Objectives］To investigate the urodynamic effects of electroacupuncture at CiLiao(BL 32)on overactive bladder(OAB)in rats induced by cyclophsphamide(CYP)and expressions of calcitonin-gene related peptide(CGRP)and SP in dorsal horn of spinal cord.［Methods］Twenty five Sprague-Dawley rats were randomly divided into:control group(n=5)，chronic OAB group(n=10)，chronic OAB+electroacupuncture group(n=10).OAB model was established by intraperitoneal injection(i.p.i)of cyclophsphamide，continuous cystometry was performed to detectinter- contraction interval，basal，threshold，micturition voiding pressure before and after electroacupuncture.The expressions of CGRP and SP in the dorsal horn of spinal cord were detected by immunohistochemical method.［Results］Compared with control group，inter-contraction interval was decreased(P＜0.05)and basal pressure was increased(P＜0.01)in both OAB and ele-ctroacupuncture group before acupuncture.While basal pressure was decreased and inter-contraction interval was increased significantly in acupuncture group compared with those in control group(P ＜0.01).Comparison with control group，the mean optical density(OD)value of SP and CGRP positive products in the dorsal horn of sacral cord in OAB group was increased significantly(P ＜0.05)，while compared with OAB group，the mean OD value of SP and CGRP in acupuncture group was decreased(P ＜0.05).［Conclusions］Electroacupuncture at CiLiao could inhibit the overactive bladder induced by cyclophsphamide in rats by decreasing the SP and CGRP expressions in the dorsal horn of spinal cord.

Key words:electroacupuncture;overactive bladder;substance P;calcitonin gene-elated peptide;urodynamic

R277.5

A

1671-7295(2012)03-0220-05

遼寧省自然科學(xué)基金資助項目(20082205)

2012-02-15;

2012-04-23

孫衛(wèi)兵(1966-)，男，遼寧大連人，教授，主任醫(yī)師。E-mail:massurm@163.com

齊清會，教授。E -mail:qiqh@medmail.com.cn