周峻荔，韋紅英，吳 華，胡艷玲，梁偉玲

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)在人群中分布廣泛，具有高度多態(tài)性，突變率低，其重復(fù)序列短，易于PCR擴(kuò)增，近年來(lái)成為血友病A家系連鎖分析中最常用的DNA遺傳標(biāo)記［1］。由于STR存在地區(qū)和民族差異性，2010年7月～2011年7月，本文選擇FⅧ基因內(nèi)外的 5個(gè) X-STR位點(diǎn)(F8Int22、F8Int13、DXS1073、DXS9901、DXS1108)，運(yùn)用熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳自動(dòng)檢測(cè)的方法，對(duì)廣西地區(qū)100例無(wú)關(guān)女性個(gè)體進(jìn)行STR多態(tài)性分析，獲得相關(guān)的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，為該地區(qū)血友病A攜帶者診斷和產(chǎn)前診斷提供可靠信息。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取無(wú)血緣關(guān)系的健康女性100例，來(lái)源于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒童保健科門診，年齡(7.2±4.33)歲。個(gè)體三代均為廣西人群，民族為漢族或壯族。

1.2 方法

1.2.1 熒光標(biāo)記PCR 抽取受試者的靜脈血2 mL，EDTA抗凝，運(yùn)用血液DNA提取試劑(Qiangen)，按照試劑說(shuō)明書步驟提取DNA，提取的DNA通過(guò)紫外分光光度儀測(cè)其濃度和含量。引物合成(上海生工)參見文獻(xiàn)［2，3］，引物序列見表1。PCR反應(yīng)的總體積為20 μL，MIX 10 μL，模板1 μL，上下游引物各取0.4 μL(10 μmol/L)，運(yùn)用ABI 2720 PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:預(yù)變性95℃5min，變性95℃ 30 s，退火60℃ 45 s，延伸72℃ 5 min，30個(gè)循環(huán)后，再延伸72℃ 5 min。

表1 各位點(diǎn)的引物序列及熒光標(biāo)記

1.2.2 毛細(xì)管電泳和STR分型 去離子甲酰胺、GeneScan-500［ROX］分子量標(biāo)準(zhǔn)物、PCR混合產(chǎn)物按9∶0.6∶0.6混合均勻，離心，置95℃變性3 min，立即置冰上10 min，運(yùn)用ABI 3100基因分析儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，DNA基因分型采用CeneScan及Genotyper軟件。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用PowerStatsV12.xls軟件計(jì)算5個(gè)STR位點(diǎn)的相關(guān)遺傳學(xué)數(shù)據(jù);通過(guò)計(jì)算χ2值，應(yīng)用SAS軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度的檢測(cè)(P值＞0.05)［4］，計(jì)算公式:χ2=(觀察雜合率－期望雜合率)2÷期望雜合率。P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 STR分型結(jié)果 見圖1。

2.2 STR位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果 5個(gè)STR位點(diǎn)的基因片段長(zhǎng)度及其等位基因頻率見表2。

圖1 毛細(xì)管電泳圖

2.3 STR位點(diǎn)的相關(guān)遺傳學(xué)數(shù)據(jù) 多態(tài)信息量(PIC)、個(gè)體識(shí)別能力(DP)、遺傳標(biāo)記雜合率(H)見表3。

表3 STR位點(diǎn)的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)

2.4 Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢測(cè)結(jié)果見表4。

表4 Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢測(cè)

3 討論

血友病A是最常見的X染色體隱性遺傳出血性疾病，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外部分學(xué)者多選用熒光PCR同時(shí)擴(kuò)增數(shù)個(gè)STR位點(diǎn)的方法，以達(dá)到快速診斷血友病A的目的。目前已知在FⅧ基因內(nèi)外存在14個(gè)STR位點(diǎn)，6個(gè)位于基因內(nèi)，在國(guó)內(nèi)外研究中最為常用的兩個(gè)位點(diǎn)為內(nèi)含子13(F8Int13)和內(nèi)含子22 (F8Int22)［5］，已被選入我們的課題研究中。在迄今的報(bào)道中，F(xiàn)8Int13的最大雜合率為91%［6］，F(xiàn)8Int22的最大雜合率為79%［7］;同時(shí)我們還選定了基因外的3個(gè)STR位點(diǎn)(DXS1073、DXS1108、DXS9901)，其中DXS9901和DXS1073在中國(guó)上海漢族人群中存在較為理想的雜合率［2］。

表2 各位點(diǎn)的等位基因及其頻率

STR存在地域和民族差異性，壯族和漢族為廣西最大的2個(gè)民族，我們選取廣西地區(qū)100例壯、漢族無(wú)關(guān)個(gè)體女性作為研究對(duì)象，對(duì)其FⅧ基因內(nèi)外的5個(gè)STR位點(diǎn)進(jìn)行了遺傳多態(tài)性分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)8Int22、F8Int13、DXS1073、DXS9901、DXS1108的H分別為42%、56%、57%、78%、40%，其中F8Int22、F8Int13這兩個(gè)位點(diǎn)的 H與國(guó)內(nèi)報(bào)道一致［2，8，9］，但低于國(guó)外報(bào)道［6，7］。DXS1073、DXS9901的H與上海漢族人群相近。DXS1108在國(guó)外的研究中顯示有較高的H［3］，但在中國(guó)地區(qū)的H低，考慮這種差異性不僅來(lái)自于地域和民族，還可能與樣本數(shù)量和遺傳背景有一定關(guān)系。

一般來(lái)說(shuō)，STR的H越高，其PIC越豐富［9］，F(xiàn)8Int22、F8Int13、DXS1073、DXS9901、DXS1108的PIC值分別為0.43、0.59、0.59、0.82、0.42。通過(guò)計(jì)算χ2值，5個(gè) STR的基因型頻率均符合 Hardy-Weinberg遺傳平衡，可用于群體的遺傳學(xué)分析。其中F8Int13、DXS1073、DXS9901的H較高，且存在較為理想的PIC，其對(duì)應(yīng)的DP分別為0.819、0.824、0.945，均達(dá)0.8以上，3個(gè)位點(diǎn)的聯(lián)合DP(TDP)為0.982，其計(jì)算公式為:TDP=1－(1－DP1)(1－DP2)…(1－DPn)［10］。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)8Int13、DXS1073、DXS9901這3個(gè)位點(diǎn)具有高度遺傳性，可選為廣西地區(qū)血友病A家系連鎖分析的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，這不僅對(duì)今后廣西地區(qū)血友病A的基因診斷、產(chǎn)前診斷方面有著重要意義，而且在血友病A的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷、移植前基因診斷，以及在X連鎖的單基因遺傳病的診斷上也有一定的借鑒價(jià)值。

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