左澤平，王志斌，郭玉東，王碧松，高 陽

（北京市藥品檢驗所，北京 100035）

發(fā)熱是多種疾病常見的共有臨床表現，大多發(fā)熱性疾病患者的體溫曲線變化往往反映病情變化和病變的特點。近年來各種大鼠發(fā)熱模型的建立為解熱藥物的研究提供了重要依據。目前報道的常用大鼠發(fā)熱模型有干酵母、LPS、2，4-二硝基酚、角叉菜膠等發(fā)熱模型，其中最常用的是干酵母、LPS大鼠發(fā)熱模型。由于動物自身特點和環(huán)境因素的綜合影響，不同文獻報道的同種發(fā)熱模型的發(fā)熱趨勢，如發(fā)熱高峰，峰值時間，發(fā)熱時程等各不相同。

為提高各種大鼠發(fā)熱模型的可利用度，深入研究不同發(fā)熱模型大鼠的發(fā)熱特點，本實驗中，采用適應性較好、應激反應小的雄性SD大鼠在同一實驗室環(huán)境中（溫度22±2℃，濕度50％ ±2％），對大鼠干酵母、2，4-二硝基酚、LPS、細菌內毒素（標準品）發(fā)熱模型的發(fā)熱過程，發(fā)熱特點進行評價。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：雄性SD大鼠，級別：SPF級；許可證號：SCXK（京）2006-0009，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2 實驗試劑：氯化鈉注射液，批號：

101217406，石家莊四藥有限公司；高活性干酵母粉，批號：20110104W，安琪酵母股份有限公司；細菌內毒素國家標準品（9000EU），批號：981，中國藥品生物制品檢定所；脂多糖（LPS），批號：

L2880，Sigma公司。

1.1.3 實驗儀器：TE2101-L電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；PB602-N電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；MC-106B歐姆龍電子體溫計（大連歐姆龍有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物的準備：正式試驗前，實驗動物在實驗環(huán)境（溫度22℃ ±2℃，相對濕度50％ ±2％）中適應3 d，每日早晚各一次對大鼠施行適應性測量肛溫操作，實驗前6 h禁食不禁水，測定肛溫前讓動物排空糞便［1］。每次測溫前電子體溫計探頭涂凡士林，插入大鼠直腸3 cm（可在3 cm用橡膠或膠布等固定，確保每次插入深度一致），待讀數穩(wěn)定以后記錄體溫值。

1.2.2 皮下注射干酵母和2，4-二硝基苯酚復制大鼠發(fā)熱模型：雄性 SD大鼠60只，體重（210 g～240 g，于實驗當日在實驗前測大鼠體溫3次，取其平均值作為基礎體溫，其中若體溫大于38.3℃或相鄰兩次體溫差值大于0.5℃的動物淘汰。篩選出合格大鼠50只大鼠隨機分為5組，每組10只：空白組皮下注射0.9％氯化鈉注射液（10 m L/kg）；干酵母A組皮下注射：20％現配的高活性干酵母混懸液（10 m L/kg）；干酵母 B組皮下注射10％現配的高活性干酵母混懸液（10 m L/kg）；2，4-二硝基苯酚A組皮下注射現配的2，4-二硝基苯酚30 mg/kg；2，4-二硝基苯酚 B組皮下注射現配的2，4-二硝基苯酚15 mg/kg，給藥體積均為10 m L/kg。干酵母A、B組分別在皮下注射干酵母混懸液0.5 h后開始監(jiān)測大鼠體溫，此后每間隔1 h監(jiān)測體溫1次，供監(jiān)測13 h，次日再測一次24 h體溫；2，4-二硝基苯酚A、B組分別在皮下注射后，前1 h每20 m in測溫1次，此后每0.5 h測溫1次，監(jiān)測7 h。計算各組各監(jiān)測點升溫值（實測體溫與基礎體溫差值），繪制平均升溫曲線；比較不同模型的發(fā)熱過程和特點。

1.2.3 腹腔注射細菌內毒素和脂多糖復制大鼠發(fā)熱模型：按1.2.2項下方法測大鼠基礎體溫并篩選，篩選出的50只合格大鼠隨機分為5組，每組10只?？瞻捉M腹腔注射0.9％氯化鈉注射液（10 mL/kg）；內毒素A組腹腔注射細菌內毒素60 EU/kg；內毒素B組腹腔注射細菌內毒素120 EU/kg；脂多糖A組腹腔注射脂多糖20 ug/kg；脂多糖B組腹腔注射脂多糖100 ug/kg。細菌內毒素A、B組和脂多糖A、B組分別在腹腔注射后0.5 h開始測溫，此后每0.5 h測溫1次，共監(jiān)測8 h；空白組在對應模型的各個體溫監(jiān)測點均平行監(jiān)測。計算各模型各時間點升溫值（實測體溫與基礎體溫差值），繪制平均升溫曲線；比較不同模型的發(fā)熱過程和特點。各模型基礎體溫見表1。

表1 各模型大鼠基礎體溫值Tab.1 The value of basal body temperature in the rats

2 實驗結果

2.1 干酵母發(fā)熱模型

結果如圖1所示：SD大鼠皮下注射干酵母后，開始時體溫降低，A組（20％干酵母）最大降溫幅度為0.04℃（ΔT=-0.04℃），B組（10％干酵母）為0.32℃（ΔT=-0.32℃）。注射2 h后，大鼠體溫迅速上升，6～7 h達到峰值，A組峰值為2.25℃，B組峰值為2℃，此后升溫曲線處于峰值平臺期并能維持6 h。注射后12 h大鼠體溫開始下降，直至24 h升溫值才降至0.6℃以下。兩組大鼠升溫趨勢一致。注射干酵母后，隨體溫變化大鼠出現開始時體溫降低，足、唇蒼白，后隨體溫逐漸升高，均出現蜷縮，足部、耳廓、嘴唇尾深紅發(fā)燙，大部分大鼠有豎毛，趴伏，呼吸增快等現象。

2.2 2，4-二硝基苯酚發(fā)熱模型

如圖2所示：SD大鼠皮下注射2，4-二硝基苯酚后，體溫立即迅速增高，20 min即升至0.6℃以上。注射后1～1.5 h達到峰值，A組（30 mg/kg）峰值達到3.09℃；B組（15 mg/kg）峰值為1.48℃。此后體溫開始逐漸恢復，B組在注射后3h即監(jiān)測到體溫降至0.6℃以下，而A組則能維持到注射5h以后。兩劑量組大鼠升溫趨勢一致。實驗過程中，A組大鼠在注射2，4-二硝基苯酚后隨體溫增高都出現了仰臥、流涎、呼吸急促、癱軟無力等癥狀，后隨著體溫逐漸下降，癥狀減輕至消失。B組則未出現明顯的以上癥狀。

2.2 LPS發(fā)熱模型

如圖3所示：腹腔注射 LPS（20μg/kg）30 min后，大鼠即出現體溫顯著升高，隨即在約2 h和4 h時出現兩個高峰，最大峰值為1.13℃。注射后6 h監(jiān)測到體溫降至 0.6℃以下。大鼠腹腔注射 LPS（100 μg/kg）30 min時開始出現體溫顯著升高，隨后在2 h，4 h，6 h時出現3個高峰，呈現明顯的三相熱，最大發(fā)熱峰值為1.58℃，注射后8 h監(jiān)測到體溫降至0.6℃以下。在腹腔注射LPS后，A組（100μg/kg）大鼠產生三相熱過程中，出現豎毛、寒顫、精神萎靡，甚至伴有腹瀉等癥狀。B組（20μg/kg）大鼠也出現精神萎靡，寒顫等癥狀，但只有個別出現輕微腹瀉。

圖1 SD大鼠干酵母發(fā)熱模型升溫曲線Fig.1 The elevated temperature curves in the dry yeast-induced rat feaver models

圖2 SD大鼠2，4-二硝基苯酚發(fā)熱模型升溫曲線Fig.2 The elevated temperature curves in the 2，4-dinitrophenol-induced rat feavermodels

圖3 SD大鼠脂多糖（LPS）發(fā)熱模型升溫曲線Fig.3 The elevated temperature curves in the lipopolysaccharide-induced rat feavermodels

2.3 細菌內毒素發(fā)熱模型

如圖4所示：腹腔注射細菌內毒素后，A、B組均在30 m in即能檢測到體溫顯著升高，大鼠升溫呈現明顯的雙相熱，在1 h～1.5 h、3 h時出現高峰，最高峰值分別為0.99℃和0.93℃。注射后（4.5 h～5 h監(jiān)測到大鼠體溫降至0.6℃以下。注射細菌內毒素后，發(fā)熱大鼠大部分出現寒顫、戰(zhàn)栗、豎毛等癥狀。

2.4 各發(fā)熱模型發(fā)熱過程及特點

如表2，從升溫起始時間看：2，4-二硝基苯酚發(fā)熱模型致熱最快，其次是LPS發(fā)熱模型和細菌內毒素發(fā)熱模型。大鼠干酵母發(fā)熱模型開始時體溫小幅度降低，注射后2～3 h體溫開始迅速升高；從峰值出現時間看：干酵母發(fā)熱模型峰值出現時間較晚，在注射后6～7 h。其他三種發(fā)熱模型均在1 h～1.5 h即開始出現峰值。LPS和細菌內毒素發(fā)熱模型呈現多項熱，有2～3個高峰；從最大峰值看： 2，4-二硝基苯酚（30 mg/kg）發(fā)熱模型峰值最高，干酵母發(fā)熱模型也較高，其次是 LPS發(fā)熱模型，而細菌內毒素峰值不超過1℃；從發(fā)熱時程（以平均升溫值大于0.6℃為發(fā)熱標準看：發(fā)熱時程最長的是干酵母模型，能持續(xù)20 h左右，發(fā)熱時程最短為2，4-二硝基苯酚（15 mg/kg）發(fā)熱模型，只能持續(xù)升溫3 h左右，LPS和內毒素發(fā)熱模型能維持升溫5～8 h。

圖4 SD大鼠細菌內毒素發(fā)熱模型升溫曲線Fig.4 The elevated temperature curves in the bacterial endotoxin-induced rat feaver models

表2 大鼠發(fā)熱模型體溫升高趨勢Tab.2 The trends of body temperature elevation in the ratmodels

3 討論

大多數發(fā)熱性疾病，體溫升高與體內病變有著內在的依賴關系，可以說，發(fā)熱常是疾病發(fā)生和發(fā)展的信號，必須引起重視［2］。研究證明，發(fā)熱是由外致熱原刺激機體的產內生致熱原細胞釋放內生致熱原，后者作用于體溫正調節(jié)調節(jié)中樞，釋放中樞正調節(jié)介質，使體溫調定點上移，同時作用于相關體溫負調節(jié)中樞，釋放負調節(jié)介質，抑制體溫過高［3-5］。

干酵母所致的發(fā)熱是由于注射部位的局部潰爛引發(fā)的劇烈炎癥反應，是最常用的大鼠發(fā)熱模型［6］。實驗結果顯示：干酵母發(fā)熱模型大鼠經過短時間降溫后體溫迅速增高，并能在高峰維持一個高峰平臺期，注射24 h后仍能觀察到注射局部有明顯的炎癥癥狀。從實驗結果可見兩組動物發(fā)熱趨勢基本一致，且升溫幅度與注射的干酵母濃度呈正比，說明干酵母致大鼠發(fā)熱模型升溫作用持久穩(wěn)定。在具體實驗中，可根據受試藥物解熱作用強弱選用合適的干酵母濃度。結合干酵母所致大鼠發(fā)熱的原因及升溫特點，該模型應適用于解熱作用持久，藥效較為顯著的解熱藥物研究。

2，4-二硝基酚為一強的代謝刺激劑，皮下注射2，4-二硝基酚能刺激動物出現無菌性炎癥，為非感染性發(fā)熱模型［7］。從實驗結果可以看出，2，4-二硝基酚所致大鼠發(fā)熱程度與熱程與其濃度呈正比。并且在發(fā)熱過程中，該模型大鼠出現的仰臥、流涎、呼吸急促、癱軟無力等癥狀與其升溫的幅度有直接關系，即升溫值越高，出現癥狀越明顯。2，4-二硝基苯酚作用迅速，短暫，升溫幅度高，不適用于作用緩慢、持久的解熱藥物解熱作用的考察，而適用于作用迅速，療效顯著，用于治療非感染性發(fā)熱的解熱藥物研究。

脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細菌的內毒素（ET）的活性成分，因此細菌內毒素和LPS的致熱原理是一致的，即作為致熱原激活單核巨噬細胞產生內生致熱原導致機體發(fā)熱。研究證實微量的 LPS就能引起劑量依賴性發(fā)熱，通常劑量（20～250μg/ kg）的LPS可引起雙相或三相熱，降低劑量則表現單相熱，解熱實驗常用LPS劑量為20μg/kg和100 μg/kg［8，9］。本實驗中 20μg/kg劑量致大鼠 0.5 h產生的發(fā)熱高峰可能是應激性發(fā)熱，因此不考慮為第一相熱，即20μg/kg能致大鼠產生雙相熱，100 μg/kg能致大鼠產生三相熱。發(fā)熱整體趨勢與文獻報道一致，但最大峰值的時間不同，初步判斷是由動物品系和實驗室環(huán)境因素所導致。由于致熱原理一致，探索性建立大鼠細菌內毒素標準品的發(fā)熱模型，其發(fā)熱特點為明顯雙相熱，但從升溫曲線看出細菌內毒素高低劑量的升溫幅度差異很小，提示該模型的致熱作用在一定范圍內與劑量呈正比，但超過一定范圍后加大劑量，大鼠升溫值可能并無明顯增幅，其原因有待進一步研究。LPS發(fā)熱模型動物升溫過程中，出現的癥狀的程度與發(fā)熱程度呈正比，其癥狀與臨床感染性炎癥所致發(fā)熱相似，因此該模型常用于解熱藥物篩選及炎性發(fā)熱機制的探討，可適用于抗炎抗病毒類解熱藥物解熱作用及機制的研究。實驗過程中，觀察到的100μg/kgLPS引起大鼠出現豎毛、寒顫、精神萎靡并伴有腹瀉等癥狀與升溫幅度并沒有直接關聯，即升溫高或低都出現了上述癥狀。20μg/kg組大鼠也出現精神萎靡，寒顫等癥狀，但只有個別出現輕微腹瀉。

以上同種發(fā)熱模型組間比較看出，同種外致熱原所致發(fā)熱模型中，所用外致熱原濃度與升溫起始時間沒有明顯聯系，但可以明顯看出外致熱原濃度越高，發(fā)熱峰值出現時間延遲，發(fā)熱最大峰值越高，發(fā)熱時程延長。解熱藥物研究中，選擇大鼠發(fā)熱模型應綜合考慮藥物和模型特點。這其中要考慮：解熱藥的起效時間是否在模型升溫之后；解熱藥的作用時間是否在模型的熱程內；解熱藥的藥效強度是否能適用于模型；解熱藥的解熱原理是否與模型的致熱原理相符。對于療效和作用特點不明確的藥物，建議選用熱程長，且發(fā)熱穩(wěn)定的干酵母模型，以確保能檢測藥物解熱作用的全過程。

實驗過程中發(fā)現，正式實驗前的適應性測溫非常重要。大鼠在未適應測溫操作之前，測得的體溫偏高，而在3～5 d，2～3次/d的適應性測溫后，大鼠體溫穩(wěn)定，淘汰率很低。實驗中測溫操作頻繁，加上造模后影響大鼠正常飲食，禁食時間過長會影響大鼠體溫，以6 h為宜。為確?；A體溫的準確性，最好在實驗當天，先適應性測溫一次，15～30 m in后再測基礎體溫。除溫度和濕度外，噪聲干擾會使大鼠體溫應激性升高，因此在大鼠適應期和正式實驗中，都應保持安靜的環(huán)境。所有的外致熱原，最好是現用現配，放置過久會影響其致熱作用。在配置2，4-二硝基酚的過程中，因其在水中溶解度小，需要在配置過程中滴加少量5 mol/L NaOH震蕩至全溶，加入NaOH量過多則會刺激動物而影響實驗結果。

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