王 晶，劉 偉，袁水娟，談小倩，謝 恩，徐 平，芮 榮

（1.南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院，南京 210095；2.中國科學院上海實驗動物中心，3.上海斯萊克實驗動物有限責任公司，上海 201615）

大型實驗動物屏障系統(tǒng)環(huán)境的穩(wěn)定是保障實驗動物規(guī)?；a、供應和動物質量的基本條件。屏障系統(tǒng)內的環(huán)境微生物控制與其生產種群的來源、空氣潔凈度、物品的消毒或滅菌以及人員的進出和操作等有關。在現(xiàn)行的實驗動物設施與環(huán)境國家標準(GB14925—2001)中，只規(guī)定了靜態(tài)狀況下屏障系統(tǒng)應該達到的基本條件或標準［1］，而對動態(tài)運行中的屏障系統(tǒng)沒有作出明確的規(guī)定。在生產型屏障系統(tǒng)中，屏障內落下菌與塵埃粒子的變化會因動物飼養(yǎng)種類，密度，飼養(yǎng)工作的不同而呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。本實驗選擇兩個飼養(yǎng)不同品種動物的屏障系統(tǒng)，在不同時間段對屏障系統(tǒng)進行空氣落下菌與塵埃粒子的測定，研究生產型屏障系統(tǒng)動態(tài)環(huán)境下微生物和塵埃粒子的變化規(guī)律，并分析生產活動對環(huán)境指標的影響，為實驗動物屏障系統(tǒng)動態(tài)環(huán)境的質量標準制定提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗儀器與試劑

直徑9 cm的塑料培養(yǎng)皿，超凈工作臺，顯微鏡，生化培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌鍋，電子天平，恒溫水浴鍋，F(xiàn)LUKE983激光粒子計數(shù)器，不銹鋼傳遞罐，冰箱，無菌工作衣及無菌手套等。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(上海康潤生物科技有限公司);瓊脂粉(上海盛思生化科技有限公司)。

1.2 試驗場所環(huán)境及飼育方式

1.2.1 屏障系統(tǒng)等級及環(huán)境：清潔級屏障系統(tǒng)［Ⅰ］：小鼠飼養(yǎng)屏障，全部飼養(yǎng)小鼠，測定地點選擇該屏障小鼠飼養(yǎng)室及潔凈走廊和污物走廊。清潔級屏障系統(tǒng)［Ⅱ］：大鼠和兔飼養(yǎng)屏障，其中有兔飼育室，和大鼠飼育室，分別測定兔飼育室和大鼠飼育室。

屏障系統(tǒng)［Ⅰ］和［Ⅱ］，單個飼育室容積172 m3，房間頂部進風口6個，四角回風口4個。屏障設施保持環(huán)境條件為：溫度(22±2)℃，濕度(50± 10)%，照明為晝夜交替各12 h。通風換氣次數(shù)為15次/h左右。

1.2.2 飼育方式：飼養(yǎng)生產工作時間為7∶00～15∶00，實驗期間噴霧消毒［2］時間為13∶00。大小鼠采用塑料籠具飼養(yǎng)，顆粒飼料飼喂，單獨水瓶飲水，每日更換部分籠具。添加飼料及更換水瓶。小鼠籠底板面積0.042 m2，籠內高度0.13 m，室內采用飼育架多層放置，小鼠房間放置小鼠籠1 728個，小鼠飼育密度10籠/m3，大鼠籠底板面積0.09 m2籠內高度0.18 m，大鼠房間放置大鼠籠600個，飼育密度約為3.5籠/m3，兔采用雙層鐵籠飼養(yǎng)，底板面積0.45 m2，籠內高度0.42 m，兔房放置兔籠288個，飼育密度約為1.67籠/m3。

1.3 落下菌與塵埃粒子的采集

普通瓊脂培養(yǎng)皿和激光粒子計數(shù)器于超凈臺紫外線照射20 min后，用無菌密封袋密封，用酒精噴霧消毒后從傳遞窗傳入。采樣人員經過沐浴后穿著無菌隔離衣，無菌隔離腳套，戴無菌口罩和無菌手套后進入。

培養(yǎng)皿放置位置：動物房一條對角線上取3點，正中一處，兩邊距墻1 m各放一個，清潔走廊，污染走廊等間距放置3個。放置方法：放置于地面，平板蓋打開，扣放于平板旁，計時30 min。塵埃粒子采樣方法：使用激光粒子計數(shù)器測定粒子濃度直徑≥0.3μm粒子濃度，采樣器放置高度1 m，采集空氣體積設定1 L。

放置時間：00∶00，06∶00，11∶00，16∶00，樣品重復采集3次。

1.4 樣品處理

1.4.1 動物房落下菌數(shù)量分析：采集好的培養(yǎng)皿放入37℃生化培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24～48 h，取出于超凈臺中計錄菌落數(shù)，屬于相同房間的培養(yǎng)皿加權取平均值為平均菌落數(shù)。采用SPSS分析軟件［3］分析統(tǒng)計結果。

1.4.2 空氣塵埃粒子數(shù)統(tǒng)計：從激光粒子計數(shù)器讀取空氣中直徑≥0.3μm塵埃粒子數(shù)量，采用 S PSS分析軟件分析統(tǒng)計結果。

2 結果

2.1 落下菌落數(shù)量分析

屏障系統(tǒng)1內清潔走廊、污物走廊工作日落下菌數(shù)量在11∶00時均顯著高于其余時間(P＜0.05)，在其它三個時間差異不顯著(P＞0.05)。小鼠飼育室工作日落下菌數(shù)量在11∶00時顯著高于06∶00時和16∶00時(P＜0.05)，與00∶00時差異不顯著(P＞0.05)，小鼠飼育室工作日落下菌數(shù)量在00∶00時、06∶00時和16∶00時三個時間差異都不顯著（P＞0.05）。

屏障系統(tǒng)1內清潔走廊、污物走廊休息日落下菌數(shù)量在各時間段差異均不顯著（P＞0.05）。小鼠飼育室在休息日落下菌數(shù)量各時間點差異均不顯著（P＞0.05）。（表1）。

屏障系統(tǒng)2兔飼育室工作日落下菌數(shù)量在11∶00時均顯著高于其余時間（P＜0.05），在其它三個時間差異不顯著（P＞0.05）。大鼠飼育室工作日落下菌數(shù)量在11∶00時顯著高于06∶00時和16∶00時（P＜0.05），在16∶00時顯著低于00∶00時和06∶00時（P＜0.05），00∶00時與06∶00之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 直徑≥0.3μm塵埃粒子數(shù)量分析

屏障系統(tǒng)2兔飼育室休息日落下菌數(shù)量在各時間段差異均不顯著（P＞0.05）。大鼠飼育室休息日落下菌數(shù)量在各時間段差異均不顯著（P＞0.05）。（表2）。

屏障系統(tǒng)1內清潔走廊、污物走廊工作日塵埃粒子數(shù)在11∶00時均顯著高于其余時間（P＜0.05），在其它三個時間差異不顯著（P＞0.05）。小鼠飼育室工作日塵埃粒子數(shù)在11∶00時顯著高于其余時間（P＜0.05），在00∶00時顯著高于06∶00時和16∶00時（P＜0.05）。

屏障系統(tǒng)1內清潔走廊、污物走廊休息日塵埃粒子數(shù)在各時間段差異均不顯著（P＞0.05）。小鼠飼育室休息日塵埃粒子數(shù)在00∶00時顯著高于其余時間（P＜0.05），在06∶00時顯著高于11∶00時（P＜0.05），11∶00時和16∶00時差異不顯著（P＞0.05）（表3）。

屏障系統(tǒng)2兔飼育室工作日塵埃粒子數(shù)在11∶00時均顯著高于其余時間（P＜0.05），在16∶00時顯著高于00∶00時（P＜0.05），00∶00時與06∶00時差異不顯著（P＞0.05）。大鼠飼育室工作日塵埃粒子數(shù)在16∶00時顯著低于其余時間（P＜0.05），在其它三個時間差異不顯著（P＞0.05）。

屏障系統(tǒng)2大鼠飼育室休息日塵埃粒子數(shù)在各時間段差異均不顯著（P＞0.05）兔飼育室休息日塵埃粒子數(shù)在11∶00時均顯著高于其余時間（P＜0.05），在16∶00時顯著高于00∶00和06∶00時（P＜0.05），00∶00時與06∶00時差異不顯著（P＞0.05）。（表4）。

表1 屏障系統(tǒng)1內小鼠飼育室和潔凈與污物走廊落下菌的檢測結果字典Tab.1 Detection of airfall bacteria in the mice room and corridor of barrier systemⅠ

表2 屏障系統(tǒng)2內大鼠飼育室與兔飼育室落下菌的檢測結果字典Tab.2 Detection of airfall bacteria in the rat room and rabbit room of barrier systemⅡ

表3 屏障系統(tǒng)1內小鼠飼育室和潔凈與污物走廊塵埃粒子的檢測結果Tab.3 Detection of dust in the m ice room and corridor of barrier systemⅠ

表4 屏障系統(tǒng)2內大鼠飼育室與兔飼育室字典塵埃粒子的檢測結果Tab.4 Detection of dust in the rat room and rabbitroom of barrier systemⅡ

3 討論

在符合國家標準的靜態(tài)實驗動物屏障系統(tǒng)引入實驗動物繁育群后，屏障系統(tǒng)內各項環(huán)境和空氣微生物指標均會發(fā)生明顯的變化。潔凈走廊，污物走廊和動物飼育室內落下菌和塵埃粒子數(shù)量均會升高，但由于動物生產的周期性和動物生活習性的相對固定，落下菌和塵埃粒子又隨著晝夜和不同生產時間產生規(guī)律性的變化。

屏障系統(tǒng)［Ⅰ］內潔凈走廊、污物走廊和小鼠飼育室和屏障系統(tǒng)［Ⅱ］內大鼠飼育室和兔飼育室內在工作日落下菌數(shù)量11∶00時均顯著高于06∶00時和16∶00時，表明飼養(yǎng)活動可使屏障內落下菌與塵埃粒子數(shù)明顯升高，人的飼養(yǎng)管理操作，如更換籠器具、配種、離乳、添加飼料等工作，可以增加落下菌與塵埃粒子的數(shù)量，這與實驗型屏障系統(tǒng)變化規(guī)律不同，實驗型屏障生產系統(tǒng)工作量較小，落下菌數(shù)量相對較低［4］。而潔凈走廊、污物走廊、小鼠飼育室、大鼠飼育室和兔飼育室內落下菌數(shù)量在16∶00時明顯降低，表明飼養(yǎng)結束后噴霧消毒可使屏障內落下菌與塵埃粒子數(shù)明顯下降，噴霧形成的大量液滴在空氣中會黏附大量塵埃粒子，由于重力作用很快降落到地面上，減少了空氣中落下菌與塵埃粒子的數(shù)量。大小鼠飼育室在00∶00時落下菌和塵埃粒子數(shù)量較高，表明屏障內大、小鼠夜間活動較多，這與大、小鼠屬于夜行性動物的行為特癥有關。屏障系統(tǒng)［Ⅰ］內污物走廊內落下菌與塵埃粒子數(shù)始終高于潔凈走廊，主要原因是潔凈走廊由于其空氣壓力梯度最高，排風能力強，細菌和塵埃含量始終保持在一個較低的水平。污物走廊在工作日則由于開門、門縫及壓差等緣故，使飼育室內的細菌與塵埃粒子進入，造成污物走廊細菌和塵埃粒子數(shù)量升高。

屏障系統(tǒng)［Ⅱ］中大鼠飼育室內的空氣落下菌和塵埃粒子數(shù)量都遠遠高于兔飼育室和屏障系統(tǒng)1中小鼠飼育室。其原因在于：大、小鼠均為塑料飼育籠內鋪設木屑墊料籠養(yǎng)，但大鼠的體型和活動量均大于小鼠，且飼料、飲水和排泄物都多于小鼠，大鼠的活動可以使時飼養(yǎng)籠中的細菌和塵埃更多的漂浮在空氣中。

在屏障系統(tǒng)［Ⅰ］和［Ⅱ］中，污物走廊、小鼠飼育室、兔和大鼠飼育室內落下菌和塵埃粒子數(shù)量均高于國家標準GB14925—2001對靜態(tài)實驗動物環(huán)境設施的要求，

其中大鼠飼育室都在100個/皿以上，而小鼠和兔飼育室在100個/皿以下，其中小鼠飼養(yǎng)室與張華瓊等報道的結果動物飼養(yǎng)間空氣落下菌數(shù)可控制在100個/皿以下一致［5］。而潔凈走廊除工作日11∶00外，落下菌數(shù)量均在3個/皿以下?？梢姡瑒討B(tài)屏障系統(tǒng)內各功能區(qū)域落下菌與塵埃粒子數(shù)量與區(qū)域功能，工作狀態(tài)和動物品種有關。因此，在實際生產和環(huán)境監(jiān)測中中，應根據(jù)飼養(yǎng)的動物種類、密度和飼養(yǎng)方式和不同功能區(qū)域來分別制定相應的落下菌和塵埃粒子監(jiān)控指標。

空氣中的塵埃粒子的數(shù)量多少可以直接反映空氣的潔凈程度，在屏障系統(tǒng)中，空氣經過預初效，初效，中效，高效四級過濾后進入，對于直徑≥0.3 μm的塵埃，可達到99.97％的過濾效果［6，7］。屏障中塵埃粒子主要來源為動物和人的活動，通過對空氣中塵埃粒子的監(jiān)測，可以間接反映動物與人的活動情況，而空氣中的微生物一般附著在塵埃粒子上，塵埃粒子濃度的變化可以間接反映飼育室內空氣細菌量的變化。塵埃粒子對動物和人的影響大部分是通過呼吸道引起的，少量是通過皮膚、眼及粘膜。直徑小于2.5μm的塵埃粒子可以直接進入肺部導致疾病發(fā)生。空氣中懸浮的塵埃粒子數(shù)量分布又呈現(xiàn)一定的規(guī)律，在動態(tài)屏障系統(tǒng)空氣中直徑≥0.3μmm的塵埃粒子數(shù)最多，且變化較明顯，故本研究選擇直接≥0.3μm塵埃粒子作為空氣潔凈度指標來評價屏障系統(tǒng)空氣潔凈變化程度。

屏障系統(tǒng)［Ⅰ］和［Ⅱ］中各功能區(qū)域直徑≤0.3 μm塵埃粒子數(shù)量都顯著高于靜態(tài)屏障，且不同功能區(qū)域與不同飼養(yǎng)室之間塵埃粒子濃度不同。

本實驗通過對生產型實驗動物屏障設施內的空氣落下菌與塵埃粒子進行實時監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)屏障系統(tǒng)各功能區(qū)域空氣落下菌與塵埃粒子變化有一定規(guī)律性，且變化在一定范圍內，在實際生產中，如果細菌數(shù)量或者塵埃粒子遠遠高于平均值，則有可能發(fā)生了管理上的問題、動物微生物控制質量下降或者設備運轉出現(xiàn)故障等，這對于評價實驗動物屏障設施的動態(tài)運行，制定屏障設施動態(tài)環(huán)境控制參數(shù)以及屏障設施的維護，實驗動物微生物質量的監(jiān)控都有積極的參考意義。

［1］國家質量技術監(jiān)督局.GB14925—2001，實驗動物環(huán)境及設施［S］.2001.26-28.

［2］宗阿南，董婉維，張艷華，等.動物實驗室房間消毒方法的研究［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2003，13（6）：381-384.

［3］翟青新，沈黎，瞿葉清，等.實驗動物設施靜態(tài)與動態(tài)空氣落下菌數(shù)檢測結果分析［J］.實驗動物科學，2008，25（3）：39 -41.

［4］柯賢福，周莎桑，樓琦，等.實驗動物屏障系統(tǒng)微生物動態(tài)狀況［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2010，20（3）：47-50.

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