張 莉，許建英

（山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，太原 030001）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease COPD）是一種以氣道不完全可逆性阻塞為特征的慢性炎癥性疾病，吸煙是其發(fā)生發(fā)展的重要病因，氧化/抗氧化失衡為其主要的發(fā)病機(jī)制之一［1］。4-HNE是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)醛基產(chǎn)物中最具代表性的物質(zhì)［2］，在 COPD患者中，4-HNE水平的升高在肺部炎癥的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)和保護(hù)性抗氧化基因表達(dá)的失衡。γ-GCS是谷胱甘肽合成過程中的限速酶，它的數(shù)量、活性等直接影響谷胱甘肽的水平［3］，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)［4］吸煙所致COPD大鼠肺組織中 γ-GCS含量較之不吸煙大鼠明顯增高，研究亦證實(shí)［5］4-HNE對(duì)大鼠肺泡上皮細(xì)胞中γ-GCS的合成有明顯的促進(jìn)作用，另有部分研究表明，γ-GCS在不吸煙者肺組織中較之吸煙者有更高的水平。以往對(duì)4-HNE和γ-GCS的研究多集中在細(xì)胞水平，本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同吸煙量、吸煙持續(xù)時(shí)間對(duì)大鼠BALF及外周血4-HNE和γ-GCS表達(dá)的影響及其相關(guān)性，探討4-HNE及 γ-GCS在 COPD氧化/抗氧化失衡發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

6～8周齡雄性W istar大鼠{山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào) SXCK（晉）2009-0001}30只，平均體重（200±20）g。實(shí)驗(yàn)用香煙為湖南中煙工業(yè)公司生產(chǎn)的芙蓉牌過濾嘴香煙（煙堿1.0 mg/支，焦油12 mg/支）。大鼠4-HNE和γ-GCS酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒均購(gòu)自北京優(yōu)博奧生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立與分組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為不吸煙組、吸煙6周組和吸煙12周組，每組10只。分籠飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸科實(shí)驗(yàn)室，室溫（20±2）℃，濕度40％ ～70％，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。參照文獻(xiàn)［4］自制實(shí)驗(yàn)性大鼠被動(dòng)吸煙裝置制備模型（自動(dòng)助燃裝置連接密閉玻璃箱）。吸煙組：每次吸煙15支，大約 2 h，每天吸煙2次（上、下午各一次），每周吸煙6 d，各吸煙6周、12周，不吸煙組大鼠正常飼養(yǎng)12周，與吸煙組飼養(yǎng)條件及環(huán)境相同。

1.2.2 標(biāo)本采集：麻醉動(dòng)物，開腹暴露腹主動(dòng)脈，取動(dòng)脈血4 m L，肝素抗凝，離心并留取上清，EP管分裝，-70℃冰箱中凍存ELISA備用；左肺用4 m L生理鹽水行支氣管肺泡灌洗，緩慢地經(jīng)氣道把液體注入肺臟，再緩慢回抽液體，反復(fù)推抽4次，重復(fù)2次，最終回抽量約 5～6 m L。3 000 r/min離心 10 min后，取上清液，EP管分裝，保存于-70℃冰箱ELISA待用。

1.2.3 BALF及外周血中4-HNE含量的測(cè)定：采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（ABC-ELISA）法檢測(cè)BALF及外周血中4-HNE的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒靈敏度pg/m L。

1.2.4 BALF及外周血中γ-GCS含量的測(cè)定：采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（ABC-ELISA）法檢測(cè)BALF及外周血中 γ-GCS的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒靈敏度U/m L。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠BALF及外周血4-HNE含量的比較

吸煙6周組和吸煙12周組大鼠BALF及外周血4-HNE含量分別較不吸煙組明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01），吸煙6周組4-HNE含量較吸煙12周組低（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（表1）

2.2 各組大鼠BALF及外周血γ-GCS含量的比較

吸煙6周組大鼠BALF及外周血γ-GCS含量較之不吸煙組增高，（P＜0.05；P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；吸煙12周組γ-GCS含量低于不吸煙組（P＜0.05；P＜0.01），差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

2.3 4-HNE含量與γ-GCS含量的相關(guān)分析

采用Pearson相關(guān)分析，對(duì)4-HNE含量及γ-GCS含量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，吸煙6周組BALF及外周血中二者表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.764，r=0.674）；吸煙12周組BALF中二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r= -0.777），而在外周血中二者表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)性。

3 討論

正常情況下，肺部產(chǎn)生一定量的氧化物，同時(shí)肺部具有抗氧化系統(tǒng)，使氧化物的產(chǎn)生和清除處于平衡狀態(tài)。吸煙是COPD的主要危險(xiǎn)因素，大量的研究證明 ，吸煙者和COPD患者體內(nèi)的氧化負(fù)擔(dān)加重。4-HNE是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)醛基產(chǎn)物中最具代表性的物質(zhì)，生成后能保留在細(xì)胞膜中，只有一部分向周圍介質(zhì)中擴(kuò)散并達(dá)到一定濃度，攻擊遠(yuǎn)離原始自由基產(chǎn)生部位的靶目標(biāo)。在COPD患者中，4-HNE水平的升高在肺部炎癥的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)和保護(hù)性抗氧化基因表達(dá)的失衡。γ-GCS是谷胱甘肽合成過程中的限速酶，分為重鏈（γ-GCS-HS）和輕鏈（γ-GCS-LS）兩個(gè)亞基，它的數(shù)量、活性等直接影響谷胱甘肽的水平。谷胱甘肽是肺部抗氧化的重要屏障，可以保護(hù)細(xì)胞免受4-HNE的損傷。已知氧化應(yīng)激可刺激大鼠支氣管上皮細(xì)胞γ-GCS表達(dá)水平增加［3］。4-HNE通過對(duì)AP-1介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活對(duì)γ-GCS的合成有明顯的促進(jìn)作用。但也有研究表明，與吸煙者相比，γ-GCS在不吸煙者肺泡巨噬細(xì)胞中有更高的水平［12］。本研究發(fā)現(xiàn)：吸煙6周組大鼠 BALF及外周血4-HNE含量均顯著高于不吸煙組；吸煙 6周組大鼠BALF及外周血 γ-GCS含量較之不吸煙組增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)本研究分別對(duì)BALF及外周血中4-HNE含量與γ-GCS含量作相關(guān)性比較顯示吸煙6周組兩者的表達(dá)呈正相關(guān)，因此認(rèn)為大鼠體液中4-HNE的增加在一定程度上促進(jìn)了 γ-GCS的增加。有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠吸入香煙煙霧1 h后，小鼠肺組織切片上與對(duì)照組相比可以觀察到4-HNE水平升高［6］。吸煙者與非吸煙者相比，在誘導(dǎo)痰中4-HNE含量明顯增高。還有學(xué)者證實(shí)，隨著吸煙時(shí)間的延長(zhǎng)，支氣管肺組織中γ-GCS的mRNA及其蛋白表達(dá)水平逐漸增高，本實(shí)驗(yàn)吸煙6周組與其結(jié)論基本相符［4］。有報(bào)道研究了23例（包括11例COPD和12例非COPD）現(xiàn)在和以往有相似吸煙年包數(shù)的肺切除患者后，證實(shí)4-HNE能在肺細(xì)胞水平上調(diào)γ-GCS的 mRNA［7］。還有研究觀察了在生理學(xué)相關(guān)劑量時(shí)4-HNE誘導(dǎo)GSH生物合成的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，表明4-HNE通過JNK信號(hào)途徑誘導(dǎo)谷胱甘肽的生物合成，并指出了由AP-1驅(qū)動(dòng)在人支氣管上皮細(xì)胞γ-GCS兩個(gè)亞基的基因表達(dá)中所起的巨大作用［8，9］。上述研究均提示了4-HNE在一定程度上可以誘導(dǎo)γ-GCS的產(chǎn)生，但本實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)致該結(jié)果的確切機(jī)制尚不清楚。

表1 4-HNE含量（pg/m L）表達(dá)（n=10，±s）Tab.1 The expression of 4-HNE in BALF and peripheral blood of the rats

表1 4-HNE含量（pg/m L）表達(dá)（n=10，±s）Tab.1 The expression of 4-HNE in BALF and peripheral blood of the rats

注：△與不吸煙組比較P＜0.01；▲與吸煙6周組比較，P＜0.01△Compared with the non-smoking group，P＜0.01；▲Compared with the 6-weeks smoking group，P＜0.01

組別Groups 肺泡灌洗液BALF 外周血Peripheral blood不吸煙組Non-smoking 15.917±1.584 12.305±1.822吸煙6周組6-weeks smoking 21.376±2.80△ 18.333±2.585△吸煙12周組12-weeks smoking 28.634±2.999▲ 22.754±3.882▲

表2 γ-GCS含量（U/mL）表達(dá)（n=10，±s）Tab.2 The expression ofγ-GCS in BALF and peripheral blood of the rats

表2 γ-GCS含量（U/mL）表達(dá)（n=10，±s）Tab.2 The expression ofγ-GCS in BALF and peripheral blood of the rats

注：△與不吸煙組比較，P＜0.05；▲與不吸煙組比較，P＜0.01；●與吸煙六周組比較，P＜0.01Note：△Compared with the non-smoking group，P＜0.05；▲Compared with the non-smoking group，P＜0.01；● Compared with the 6-weeks smoking group，P＜0.01

組別Groups 肺泡灌洗液BALF 外周血Peripheral blood不吸煙組Non-smoking 13.525±2.311 11.847±1.171吸煙6周組6-weeks smoking 15.802±1.647△ 16.221±1.577▲吸煙12周組12-weeks smoking 11.527±1.606△● 9.015±1.569▲●

本研究還發(fā)現(xiàn)：吸煙12周組大鼠BALF及外周血4-HNE含量高于吸煙6周組，而吸煙12周組γ-GCS含量低于不吸煙組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析顯示吸煙12周組外周血中4-HNE與 γ-GCS表達(dá)無(wú)相關(guān)性，而在 BALF中二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示隨著4-HNE的大幅增加，γ-GCS逐漸呈下降趨勢(shì)，谷胱甘肽逐漸耗竭，長(zhǎng)期香煙煙霧暴露引起了肺部氧化/抗氧化失衡，在最終導(dǎo)致COPD的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。有研究［8］發(fā)現(xiàn)：谷胱甘肽濃度在10μmol/L 4-HNE刺激后12 h達(dá)到最高水平，24 h后谷胱甘肽的水平開始降低，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽被消耗時(shí)，細(xì)胞對(duì)4-HNE的毒性作用變得敏感。Harju等［10］通過免疫組織化學(xué)的方法對(duì)22位患有慢性阻塞性肺疾?。–OPD）的患者，20位吸煙沒有患COPD者及13位終身未吸煙者進(jìn)行研究，通過免疫電鏡方法評(píng)定，證實(shí) γ-GCS重鏈和輕鏈兩個(gè)亞單位大部分顯著地表達(dá)在大氣道，與所有吸煙者相比不吸煙者中央支氣管上皮細(xì)胞γ-GCS-HS的表達(dá)顯示更高的趨勢(shì)，與吸煙者相比 γ-GCS-HS和γ-GCS-LS在不吸煙者肺泡巨噬細(xì)胞有更高的水平。此研究還表明γ-GCS在吸煙者肺部氣道內(nèi)的免疫活性降低。另有研究也證實(shí)了該結(jié)論，該研究還發(fā)現(xiàn)γ-GCS在不吸煙非慢性支氣管炎者表達(dá)最強(qiáng)，而在吸煙者與慢性支氣管炎者的氣道內(nèi)表達(dá)下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠體液中的γ-GCS進(jìn)行測(cè)定，吸煙12周組結(jié)果與在人中央支氣管上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞中的變化基本一致［11］。已證實(shí)在生理?xiàng)l件下谷胱甘肽可以直接通過谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與4-HNE反應(yīng)形成復(fù)合物排出細(xì)胞，在4-HNE導(dǎo)致谷胱甘肽逐漸消耗中發(fā)揮作用，而在具體不同的細(xì)胞系中，該代謝途徑仍報(bào)道不一［12］。至于該解毒機(jī)制是否導(dǎo)致了本實(shí)驗(yàn)中γ-GCS的逐漸降低，尚需后續(xù)的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

氧化/抗氧化失衡是COPD的重要發(fā)病機(jī)制，近年來人們對(duì)4-HNE的認(rèn)識(shí)已逐漸深入，長(zhǎng)期接觸香煙煙霧會(huì)導(dǎo)致肺內(nèi)氧化產(chǎn)物的大量蓄積和抗氧化劑的不斷消耗，4-HNE的不斷增加與抗氧化酶 γ-GCS的逐漸消耗可能在COPD的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，在未來的發(fā)展中，進(jìn)一步深入探索二者表達(dá)的失衡與吸煙所致COPD的關(guān)系，有助于發(fā)現(xiàn)新的治療方法用以預(yù)防或治療慢性阻塞性肺疾病。

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