占玲俊，鮑琳琳，李楓棣，呂 琦，許黎黎，秦 川

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

雪貂是研究流感感染的理想動(dòng)物模型，由于其呼吸道上皮與人的呼吸道上皮相似，因此其感染的敏感性，傳播方式以及臨床癥狀與人感染的相似，常用于病毒的致病研究和疫苗的評價(jià)［1］。

檢測感染流感的雪貂病毒載量是流感的診斷，檢測和研究中常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其靈敏度高，特異性好，方法快捷。尤其對高致病性流感的檢測和研究有重要用途，當(dāng)感染樣品經(jīng)過初處理后，就不需要在ABSL-3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作，而可以轉(zhuǎn)到ABSL-2實(shí)驗(yàn)室甚至是普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)的定量檢測，免去了操作上的繁瑣和不便［1］。

熒光定量PCR系統(tǒng)體系是非常靈敏的體系，組織樣品的質(zhì)量，引物的特異性是決定 SYBR Green PCR定量結(jié)果可信度的關(guān)鍵。在準(zhǔn)備定量 PCR的樣品模板時(shí)，有多種方法可以提取RNA，由于組織樣品的成分較復(fù)雜，不同組織的最優(yōu)提取方法會(huì)不同，另外不同試劑盒提取相同的組織RNA的質(zhì)量不同，去除PCR干擾因子比如基因組DNA，鹽份，糖份，某些未知的成分的情況也不同。

最常見的RNA提取方法是柱子法和有機(jī)試劑法，其中柱子法以 Qiagen公司的 RNeasy m ini kit （cat.74106）應(yīng)用最廣泛，該試劑盒針對液體樣品，培養(yǎng)的細(xì)胞系，小鼠和大鼠的組織研發(fā)，最常用于鼻咽拭子的流感病毒載量的檢測；QIAampViral RNA M ini Kit（Qiagen）用于咽拭子或者氣道灌洗液以及培養(yǎng)細(xì)胞的 RNA的提?。?］。有機(jī)試劑以經(jīng)典的Trizol最為推崇。

在本實(shí)驗(yàn)室前期的應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，對于雪貂的鼻甲刮取物或者灌洗液的病毒定量，RNeasy mini kit （cat.74106）提取的 RNA能完全滿足 SYBR Green PCR定量的要求，但是在雪貂組織如心、肝、脾、肺、腎、腸、腦等組織中，完全按該試劑盒提取方法提取的總RNA不能滿足后期的熒光定量要求，定量PCR的溶解曲線有時(shí)不能直接發(fā)現(xiàn)問題，通常只能通過產(chǎn)物的電泳才能判斷。

前期的動(dòng)物組織病毒定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組織樣品中含有干擾熒光定量PCR的成分，因此，找到一個(gè)提取優(yōu)質(zhì)RNA，建立穩(wěn)定可靠的病毒 SYBR Green PCR定量方法非常有必要。

1 材料和方法

1.1 材料

RNeasy mini kit（Qiagen，74106）；Trizol （Invitrogen USA）， SuperScript III First-Strand Synthesis System（Invitrogen，18080-051）；熒光染料Power SYBR Green PCR Master Mix（ABI，4367659）； Taq酶（TAKARA）；分子級(jí)無菌蒸餾水 （無RNA酶和DNA酶）。

1.2 方法

1.2.1取樣和組織勻漿：取3只攻毒感染的雪貂肺和腸組織，各稱取100 mg，分別放在1 m L RLT和Trizol中，用電動(dòng)研磨器（PRO200，USA），功率選擇第3檔，1 min，將組織充分勻漿成懸液。另外，用刮匙在雪貂鼻甲上內(nèi)測刮取，將刮匙分別在DMEM中浸泡后得到懸液。

1.2.2 RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄［2］：RNA提取的4種方法如下：

經(jīng)典的Trizol法：將1 m L的Trizol裂解樣品按照經(jīng)典Trizol法提取RNA，最后的RNA樣品溶于50 μL無RNA酶的水中。

RNeasy mini kit柱子法：從1 mL的RLT樣品裂解液中取100μL樣品，按照該試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)步驟提取RNA，溶于30μL無RNA酶的水中。

改良RNeasy mini kit柱子法1：從1 m L的Trizol樣品裂解液中取100μL樣品，按照RNeasy mini kit的標(biāo)準(zhǔn)步驟提取 RNA，溶于30μL無 RNA酶的水中。

改良RNeasy mini kit柱子法2：將1 mL的Trizol裂解樣品按加入200μL氯仿后從約500μL上清液中取100μL上清液作為樣品，按照RNeasy mini kit的標(biāo)準(zhǔn)步驟提取RNA，溶于50μL無RNA酶的水中。

將上述4種方法提取的RNA用Nano drop2000紫外分光光度儀測 RNA的濃度和純度，分別取2μL、8μL、8μL、8μL上樣，1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，180 V，8 min后在凝膠成像儀中觀看RNA電泳條帶。

根據(jù) RNA電泳的質(zhì)量，取適量 RNA用SuperScript III First-Strand Synthesis System （Invitrogen，18080-051）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，取轉(zhuǎn)錄后的cDNA模板做后面的熒光定量PCR。

1.2.3 SYBR Green定量PCR［3，4］

取逆轉(zhuǎn)錄的模板2μL，按照ABIPOWER SYBR Green Mix反應(yīng)體系加樣，

Stepone定量 PCR儀上機(jī)。H3N2的引物分別為H3N2-353-F：5＇-GAA TCT GGC GGC AAG CCA AC-3＇；H3N2-540-R：5＇-ACC TGC AGC TCC GGA CCT TC-3＇。逆轉(zhuǎn)錄的特異性引物為H3N2-RT：5＇-AGC AAA AGC AGG-3＇。按照以下循環(huán)參數(shù)進(jìn)行熒光定量 PCR反應(yīng)：94℃，3 min；94℃，30 s，58℃，30 s，72℃ ，30 s，然后95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s；35個(gè)循環(huán) 。

由上述引物PCR擴(kuò)增病毒液，PCR產(chǎn)物電泳后切膠，用膠回收試劑盒 （Qiagen，MinElute Gel Extraction Kit）回收特異性產(chǎn)物條帶，紫外分光光度儀測定回收產(chǎn)物的濃度，利用公式（6.02×1023拷貝數(shù)/摩爾）x（濃度g/m L）/（MW g/mol）=copies/ m L計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)值。

定量PCR的產(chǎn)物1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀中觀看產(chǎn)物的條帶情況。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取的結(jié)果

按前述的方法提取雪貂組織的總RNA，測核酸濃度和純度見表1，雪貂的肺和腸的組織總RNA電泳，得到 RNA質(zhì)量的電泳圖（圖1），可見經(jīng)典的Trizol法提取的RNA有3條帶，28 s，18 s和5 s，而RNeasy mini kit柱子法的RNA中有基因組污染，改良RNeasy mini kit柱子法1和2提取的RNA只有28 s和18 s帶。

雪貂鼻甲刮取物的病毒懸液RNA只用紫外分光光度儀測濃度和純度。

2.2 病毒的SYBRGreen熒光定量PCR

根據(jù)組織塊重量以及RNA電泳條帶亮度分別取2μL，8μL，8μL，8μL總RNA，而鼻甲刮取物直接取8μL的總 RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后取2μL等量的 cDNA模板進(jìn)行SYBR Green熒光定量 PCR，結(jié)果如圖2。其中，鼻甲和組織的定量PCR的溶解曲線均為與標(biāo)準(zhǔn)品波峰位置重合的單一峰。

表1 四種方法提取的組織RNA的濃度和純度的比較Tab.1 Comparison of the concentration and purity of RNA isolated by the four methods

圖1 4種方法提取的雪貂的肺和腸組織的總RNA電泳圖Note：The left Fig.re：Lane1-4：Total RNA isolated from lung by RNeasy mini kit，modified RNeasy mini kit2，modified RNeasymini kit1，Trizol，respectively.The right Fig.re： Lane1-4： Total RNA isolated from intestines by RNeasy mini kit，modified RNeasy mini kit2，modified RNeasymini kit1，and Trizol.Fig.1 Total RNA run in the 1.5％agarose gel electrophoresis

將上述定量 PCR產(chǎn)物在1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳，發(fā)現(xiàn)鼻甲和組織定量的結(jié)果如下：鼻甲刮取物的產(chǎn)物是與標(biāo)準(zhǔn)品大小一致的單一的特異性條帶，而組織中只有經(jīng)典的 Trizol法提取的組織定量是與標(biāo)準(zhǔn)品一致的特異性條帶，而其它3種方法提取的模板則均有非特異性條帶，結(jié)果見圖3。

2.3 4種方法的總結(jié)［5］

根據(jù)RNA提取的質(zhì)量，后期PCR產(chǎn)物的特異性，操作過程的時(shí)間，試劑盒的成本，比較總結(jié)如表2：

圖2 定量的溶解曲線Note：2A shows themelting curves of the turbinate samples.Curve 1-5：standard，Trizol，modified RNeasymini kit2，modified RNeasy mini kit1 and RNeasy mini kit，respectively.2B shows the melting curves of the lung and intestine samples.Curves 1-5 are standard，modified RNeasymini kit2，modified RNeasymini kit1，RNeasymini kit，and Trizol for the lung tissues.Curves6-9 aremodified RNeasymini kit2，modified RNeasymini kit1，RNeasymini kit，and Trizol for the intestinal tissues.Fig.2 Melting curves of SYBR Green real time PCR quantification

3 討論

病毒感染的動(dòng)物組織，由于其成分較復(fù)雜，尤其是空腔臟器腸中含有各種干擾定量PCR成分較多，如基因組DNA，鹽份，糖份，酶等PCR抑制因子因此前期 RNA的質(zhì)量和除干擾時(shí)重要的一環(huán)［7］。RNA提取一般用柱子法和有機(jī)試劑方法，參考國外文獻(xiàn)［1，6-7］，某些專門實(shí)驗(yàn)室推薦 RNeasy m ini kit柱子法，而另外實(shí)驗(yàn)室有機(jī)方法 Trizol法。本實(shí)驗(yàn)室為選擇合適的RNA提取方法滿足后期的熒光定量PCR體系，對經(jīng)典的Trizol法，RNeasy mini kit柱子法，改良RNeasy m ini kit柱子法1和改良RNeasy mini kit柱子法2進(jìn)行比較。

圖3 SYBR Green real time PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Note：3A shows the products of the turbinate samples.Lanes 1-5 are： modified RNeasy mini kit2，modified RNeasy mini kit1，RNeasy mini kit，Trizol and standard，respectively.3B shows the products of lung and intestine samples.Lanes 1-5 are： lung tissues assayed with standard，modified RNeasy mini kit2，modified RNeasy mini kit1，RNeasy mini kit，and Trizol，respectively.Lanes 6-9 are intestine samples assayed with modified RNeasy mini kit2，modified RNeasy mini kit1，RNeasy mini kit，and Trizol.Fig.3 Products of SYBR Green real time PCRrun in 1.5％agarose gel electrophoresis

除了組織RNA和cDNA的質(zhì)量，引物的特異性也很關(guān)鍵，由于雪貂的基因背景目前無公布的信息，因此選擇合適的引物去掉組織的非特異結(jié)合也很重要。因此，對于簡單樣品鼻甲刮取物，經(jīng)典的 Trizol法、RNeasy m ini kit柱子法、改良RNeasy m ini kit柱子法1和改良 RNeasy m ini kit柱子法2提取的RNA質(zhì)量均可，在病毒的SYBR Green熒光定量 PCR中均能產(chǎn)生特異性的擴(kuò)增。另外也說明這4種提取方法的試劑體系均不對SYBR Green熒光定量 PCR產(chǎn)生干擾，引物的特異性好。

組織的RNA提取，4種方法提出的RNA質(zhì)量不同。雖然總RNA的質(zhì)量并不能完全代替組織中病毒RNA的質(zhì)量，但是能作為操作質(zhì)控。紫外分光光度儀測出A260/280除了RNeasy mini kit柱子法的值低于1.8，說明可能有基因組DNA污染，其余3種方法均在1.8～2.1之間，A260/230只有Trizol法能到達(dá)2.0左右，其余3種方法均遠(yuǎn)低于2.0，說明這3種可能有鹽分等物質(zhì)的污染。說明完全按照試劑盒的步驟對于去除雪貂的基因組效果比較差，可能需要加大裂解液的量或者減少組織量。RNA電泳電圖可見Trizol法提出來的RNA電泳3條帶最完整，并且無基因組DNA污染，RNA樣品在后面的熒光定量PCR有特異性擴(kuò)增，并且無任何干擾雜帶。只是該方法耗時(shí)比較長，并且需要在冰上操作。而RNeasy m ini kit柱子法提取的 RNA可見28 s和18 s帶，不見5 s帶，有基因組DNA污染，后期的定量PCR產(chǎn)物為多帶，結(jié)果不可信。改良RNeasy mini kit柱子法1和改良RNeasy mini kit柱子法2提取的RNA電泳均只能見到28 s和18 s帶，無基因組污染，而定量PCR產(chǎn)物為多帶，并也可見目的條帶的擴(kuò)增，其中改良 RNeasy m ini kit柱子法2的產(chǎn)物雜帶較少，目的帶比較清楚。

可見，Trizol在裂解組織樣品時(shí)，其去除基因組DNA的能力強(qiáng)于RNeasy mini kit中的RLT裂解液，并且經(jīng)典Trizol提取的RNA純度最好，對定量PCR的干擾最小。RNeasy mini kit柱子法提取的 RNA中混有的基因組DNA或者其它雜質(zhì)對定量的干擾較大。而改良法1和改良法2雖然能去除基因組DNA和某些干擾成分，但仍殘留有其他的雜質(zhì)，并對定量反應(yīng)產(chǎn)生干擾。

由此可見，對于雪貂的組織樣品，Trizol法得到的定量結(jié)果最可信，而其它的3種方法的結(jié)果在SYBR Green熒光定量PCR不太可信。雖然RNeasy mini kit柱子法在組織總 RNA提取中很被推崇，但是需要優(yōu)化才適合本實(shí)驗(yàn)室的定量體系。

表2 4種RNA提取方法在組織病毒定量中應(yīng)用的比較Tab.2 Comparison of the quantification of influenza H3N2 virus assayed with the four RNA isolation methods and Syber Green real time PCR

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