鄧志瑞， 孫晶晶， 張文舉， 陳 沁

(上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200444)

蘇丹草(Sorghum sudanense)原產(chǎn)于非洲北部的蘇丹高原，在歐洲、北美洲及亞洲大陸的熱帶和亞熱帶均有栽培，是世界各國(guó)栽培最普遍的一年生禾本科牧草之一，被稱(chēng)為禾本科牧草中的“牧草之王”［1］.由于種子質(zhì)量管理技術(shù)和相關(guān)制度的缺失，我國(guó)蘇丹草種子生產(chǎn)上的種質(zhì)非?；靵y，因此，對(duì)蘇丹草品種真實(shí)性和純度進(jìn)行鑒定十分重要［2］.種子醇溶蛋白是種子胚乳中的主要貯藏蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)不受種植環(huán)境等的影響，是植物基因類(lèi)型的表現(xiàn)特征之一［3］，其指紋研究在品種真實(shí)性和資源鑒定評(píng)價(jià)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值［4］.許多學(xué)者已經(jīng)將醇溶蛋白分析技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物種類(lèi)鑒別、基因標(biāo)記、種子純度檢驗(yàn)、遠(yuǎn)緣雜種鑒定、體細(xì)胞無(wú)性變異鑒定等方面［5-8］.醇溶蛋白電泳圖譜不僅可以表現(xiàn)植物種間的差異，也可表現(xiàn)種內(nèi)類(lèi)型的差異.建立每種植物的醇溶蛋白指紋圖譜，可以為植物資源的廣泛利用提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)［9-10］.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究影響醇溶蛋白提取和SDS-PAGE電泳效果的主要因素，優(yōu)化了蘇丹草種子醇溶蛋白提取和SDS-PAGE電泳條件，為蘇丹草種子分子水平的鑒定奠定了研究基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的蘇丹草(Sorghum sudanense)產(chǎn)自湖南，高粱(Sorghum bicolor)產(chǎn)自河北泊頭，玉米(Zea may)產(chǎn)自美國(guó)，大麥(Hordeum vulgare)產(chǎn)自加拿大.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同提取劑對(duì)蘇丹草醇溶蛋白提取的影響

用液氮研磨蘇丹草種子至粉末狀，稱(chēng)取100 mg轉(zhuǎn)移到1.5 mL Eppendorf管中，分別加入600 μL 70%乙醇、70%正丙醇、70%異丁醇、70%異丙醇、70%叔丁醇和70%乙二醇，振蕩混勻后，37℃水浴提取過(guò)夜.然后，8 000 r/min離心15 min，采用考馬斯亮藍(lán)G-250方法測(cè)定上清液蛋白濃度.把蛋白質(zhì)濃度稀釋至12 μg/μL，取5 μL蛋白溶液加入等體積的2×電泳上樣緩沖液，95℃處理5 min后上樣，以12%的分離膠進(jìn)行電泳檢測(cè)［11-16］.

1.2.2 樣品/提取劑比例對(duì)蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響

分別按種子粉末質(zhì)量與提取劑體積比(g/mL)為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶15，1∶20加入提取劑提取醇溶蛋白，以12%的分離膠進(jìn)行電泳檢測(cè).

1.2.3 還原劑DTT的濃度對(duì)蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響

配制含不同終濃度DTT(0%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，1.0%，1.5%，3.0%)的70%正丙醇提取劑，以12%的分離膠進(jìn)行電泳檢測(cè).

1.2.4 不同上樣量、不同分離膠濃度對(duì)電泳的影響

分別使用8%，10%，12%，15%的分離膠，以上述最佳提取條件下得到的蘇丹草種子醇溶蛋白為樣品，稀釋?zhuān)沟貌煌蠘涌自谙嗤蠘芋w積(10 μL)中含有的醇溶蛋白分別為10，20，30，35，40，50，60，70 μg.

1.2.5 優(yōu)化條件對(duì)其他禾本科種子醇溶蛋白分析的可行性研究

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)得到的蘇丹草種子醇溶蛋白提取和電泳優(yōu)化條件，對(duì)幾種常見(jiàn)的禾本科種子醇溶蛋白進(jìn)行提取和電泳分析，檢驗(yàn)所建立的優(yōu)化條件是否適用于其他禾本科種子.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取劑對(duì)蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響

用不同提取劑提取的醇溶蛋白電泳圖譜如圖1所示，其中1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，2～7為分別用70%乙醇、70%正丙醇、70%異丁醇、70%異丙醇、70%叔丁醇和70%乙二醇提取的醇溶蛋白.可見(jiàn)，使用不同提取劑得到的醇溶蛋白電泳圖譜存在差異，主要表現(xiàn)在譜帶豐富度和帶型不同，其中以乙醇、正丙醇和叔丁醇提取得到的電泳圖譜豐富度最好，而用乙二醇和異丁醇只能得到少量的譜帶.因此，本實(shí)驗(yàn)選擇70%正丙醇作為蘇丹草種子醇溶蛋白的提取劑.

圖1 不同提取劑對(duì)蘇丹草醇溶蛋白提取的影響Fig.1 Effects of different extracting agents on prolamin extraction from Sorghum sudanense seeds

2.2 樣品/提取劑比例對(duì)蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響

提取劑用量不同對(duì)提取蘇丹草種子醇溶蛋白有明顯影響(見(jiàn)圖2，其中1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，2～9分別為樣品/提取劑比例為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12， 1∶15，1∶20所提取的醇溶蛋白圖譜).由圖2可見(jiàn)，條帶的強(qiáng)度隨提取劑用量的增加而減弱，其中以1∶4～1∶8提取的醇溶蛋白具有豐富的譜帶，而以1∶12和1∶15提取的蛋白譜帶清晰度明顯下降，當(dāng)以1∶20提取時(shí)幾乎看不到蛋白譜帶.

圖3為不同提取劑用量，相同蛋白含量對(duì)蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響，其中1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白; 2～9分別為樣品/提取劑比例為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶15，1∶20所提取的醇溶蛋白，調(diào)整使得每孔上樣等量蛋白質(zhì)(15 μg/加樣孔).可見(jiàn)，取相同質(zhì)量的醇溶蛋白為上樣量，提取劑的比例越大，得到的圖譜條帶越豐富，提取效果越好.考慮到電泳圖的清晰程度，蛋白濃度測(cè)定的結(jié)果，以及實(shí)驗(yàn)的操作性，本實(shí)驗(yàn)選擇1∶8作為最佳提取劑比例.

圖2 不同提取劑用量(蛋白含量不同)對(duì)蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響Fig.2 Effects of different reagent dosages(different prolamin quality)on prolamin extraction from Sorghum sudanense seeds

圖3 不同提取劑用量(蛋白含量相同)對(duì)蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響Fig.3 Effects of different reagent dosages(same prolamin quality)on prolamin extraction from Sorghum sudanense seeds

2.3 還原劑DTT濃度對(duì)蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響

用含有不同濃度DTT的70%正丙醇作為提取劑，提取到的醇溶蛋白電泳圖譜如圖4所示，其中1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，2～10分別為加入還原劑DTT濃度為0%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，1.0%，1.5%，3.0%的70%正丙醇.由圖可知，DTT可以提高醇溶蛋白的提取效率，且隨著DTT濃度的升高，提取效率也相應(yīng)地提高.但當(dāng)DTT濃度超過(guò)0.2%后，已沒(méi)有顯著劑量關(guān)系.考慮到成本的因素，本實(shí)驗(yàn)選取0.2%DTT濃度的70%正丙醇作為最佳提取劑.

圖4 DTT濃度對(duì)蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響Fig.4 Effects of different reduction reagent concentrations on prolamin extraction from Sorghum sudanense seeds

2.4 上樣量、分離膠濃度對(duì)蘇丹草醇溶蛋白電泳的影響

隨著分離膠濃度的提高，醇溶蛋白的譜帶清晰度逐漸提高，并且不同濃度的分離膠得到的電泳條帶的數(shù)目也不相同(見(jiàn)圖5，其中1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白;2～9分別為上樣孔醇溶蛋白量為10，20，30，35，40，50，60，70 μg的蛋白圖譜).同一分離膠，在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著上樣蛋白含量的增多，電泳條帶也逐漸清晰.但當(dāng)醇溶蛋白的上樣蛋白量達(dá)到一定程度時(shí)，蛋白條帶開(kāi)始堆積，譜帶的清晰度也開(kāi)始下降，以至于難以區(qū)分.由圖5可知，12%或者15%的分離膠可以產(chǎn)生較好的分辨率，但當(dāng)凝膠濃度高于15%時(shí)，膠片韌性較差，容易碎裂，因此，本實(shí)驗(yàn)選取12%作為最佳分離膠濃度.在本實(shí)驗(yàn)所用電泳條件下(膠板大小為73 mm×83 mm，膠厚度為0.75 mm，共15個(gè)上樣孔)，每孔最佳上樣量為40 μg.

圖5 上樣量、分離膠濃度對(duì)電泳結(jié)果的影響Fig.5 Effects of prolamin amount per well volume and separation gel concentration on SDS-PAGE

2.5 優(yōu)化條件對(duì)其他禾本科種子醇溶蛋白分析的可行性研究

取分離膠濃度為12%，大麥、玉米、蘇丹草、高粱種子醇溶蛋白的上樣量為每孔40 μg，進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示，其中1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，2～5分別為所提取的大麥、玉米、蘇丹草、高粱的醇溶蛋白.可見(jiàn)，在該實(shí)驗(yàn)條件下，幾種禾本科種子醇溶蛋白電泳圖譜的譜帶清晰，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所建立的條件不僅可以用于蘇丹草醇溶蛋白的研究，也可以用于其他禾本科植物.

3 討論

一般來(lái)說(shuō)，醇類(lèi)的極性隨著碳鏈的增長(zhǎng)而降低，但因?yàn)橐粋€(gè)分子內(nèi)羥基上的氧可以和另外一個(gè)分子上的氫形成氫鍵，所以容易造成極性的增加.種子醇溶蛋白提取劑的選擇早期以乙醇為主，后來(lái)漸漸轉(zhuǎn)變?yōu)檎己褪宥〈迹?7］.本實(shí)驗(yàn)除了選擇上述3種試劑外，還同時(shí)研究了另外3種醇類(lèi)試劑對(duì)蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響.結(jié)果表明，不同的醇類(lèi)試劑具有不同的提取效果，其中效果較好的是正丙醇、叔丁醇，這可能是由于組成蘇丹草種子醇溶蛋白的氨基酸殘基疏水性較強(qiáng)，相對(duì)于極性稍大的乙二醇和異丙醇，極性較弱的正丙醇和叔丁醇更有利于蘇丹草種子醇溶蛋白的提取.

圖6 幾種禾本科種子醇溶蛋白電泳圖Fig.6 Electrophoresis of prolamins of several common gramineae seeds

提取劑用量是影響醇溶蛋白提取的主要因素之一［14］.司學(xué)芝等［15］在研究麥醇溶蛋白和谷蛋白的提取條件時(shí)，選擇固液比在1∶6～1∶30之間.結(jié)果表明，隨著提取劑的增加，提取的醇溶蛋白總量增高，但隨后出現(xiàn)下降，說(shuō)明提取劑的用量并非越多越好.本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明，隨著提取劑的加入，提取到的醇溶蛋白總量增加，但提取效率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì).綜合考慮蛋白含量和濃度對(duì)SDS-PAGE條帶的影響，最終選擇固液比為1∶8.

研究表明，高粱屬種子醇溶蛋白中含有較高水平的半胱氨酸殘基和巰基［7，18］.因此，還原劑的加入可增加醇溶蛋白的提取量，同時(shí)提高蛋白的多態(tài)性.DTT可用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，阻止蛋白質(zhì)中半胱氨酸之間形成的分子內(nèi)或分子間二硫鍵.由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，加入DTT后譜帶顏色加深，說(shuō)明蘇丹草種子醇溶蛋白的提取量變大.

傳統(tǒng)的SDS-PAGE分離蛋白的方法較成熟，凝膠韌性好，易于剝離，電泳圖譜較清晰［2，12］.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離膠濃度對(duì)電泳圖譜的影響較大.隨著分離膠濃度的升高，醇溶蛋白特征譜帶的清晰度也相應(yīng)提高.12%和15%范圍的凝膠可以得到比較清晰的電泳譜帶，但在譜帶的帶型以及凝膠的后處理方面，12%的凝膠較好.根據(jù)蘇丹草醇溶蛋白分子量大小，相對(duì)于8%濃度的分離膠，10%的凝膠譜帶更加清晰可辨.10%凝膠的電泳時(shí)間雖短，但膠的牢固程度較低，易破裂;15%的凝膠的分辨效率較好，凝膠的質(zhì)量也較好，但成膠的時(shí)間較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間跨度大.比較發(fā)現(xiàn)，可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟捎貌煌姆蛛x膠濃度，如為了快速鑒定可采用10%的分離膠，若要準(zhǔn)確分辨特征譜帶可采用12%的分離膠.

醇溶蛋白的上樣量也會(huì)影響電泳檢測(cè)蛋白的結(jié)果.當(dāng)?shù)鞍琢枯^小時(shí)，蛋白質(zhì)各組分含量少，所結(jié)合的考馬斯亮藍(lán)少，著色淺，效果不好;相反，過(guò)高的上樣量會(huì)使蛋白質(zhì)含量過(guò)高，電泳條帶顏色變深、帶型變寬，相近的條帶會(huì)出現(xiàn)重疊，不便識(shí)別.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蘇丹草醇溶蛋白的上樣量以40 μg時(shí)合適.

本實(shí)驗(yàn)中的禾本科醇溶蛋白圖譜表明，通過(guò)蘇丹草種子優(yōu)化的醇溶蛋白提取和電泳條件是可以應(yīng)用于其他幾種禾本科植物的，并可得到良好的分離效果.

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